Kiitos käynnistäsi Nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan tuloksen saavuttamiseksi suosittelemme uudemman selaimen käyttöä (tai yhteensopivuustilan poistamista käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä jatkuvan tuen varmistamiseksi.
Modisen muutoksen (MC) eläinmallien luominen on tärkeä perusta MC:n tutkimukselle. Viisikymmentäneljä Uuden-Seelannin valkoista kania jaettiin lumeleikkausryhmään, lihasimplantaatioryhmään (ME-ryhmä) ja nucleus pulposus -implantaatioryhmään (NPE-ryhmä). NPE-ryhmässä nikamavälilevy paljastettiin anterolateraalisella lannerangan kirurgisella lähestymistavalla ja neulalla puhkaistiin L5-nikaman runko läheltä päätylevyä. NP poistettiin L1/2-nikamasta ruiskulla ja ruiskutettiin siihen. Rustonalusluuhun porattiin reikä. Lihasimplantaatioryhmän ja lumeleikkausryhmän kirurgiset toimenpiteet ja porausmenetelmät olivat samat kuin NP-implantaatioryhmässä. ME-ryhmässä reikään asetettiin lihaspala, kun taas lumeleikkausryhmässä reikään ei asetettu mitään. Leikkauksen jälkeen suoritettiin magneettikuvaus ja molekyylibiologiset testit. Signaali muuttui NPE-ryhmässä, mutta lumeleikkausryhmässä ja ME-ryhmässä ei ollut ilmeistä signaalinmuutosta. Histologinen tutkimus osoitti, että implantaatiokohdassa havaittiin epänormaalia kudosproliferaatiota, ja IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n ilmentyminen oli lisääntynyt NPE-ryhmässä. NP:n implantaatio subkondraaliseen luuhun voi muodostaa MC:n eläinmallin.
Modiset muutokset (MC) ovat nikamien päätylevyjen ja viereisen luuytimen leesioita, jotka näkyvät magneettikuvauksessa (MRI). Ne ovat melko yleisiä henkilöillä, joilla on niihin liittyviä oireita1. Monet tutkimukset ovat korostaneet MC:n merkitystä sen yhteyden vuoksi alaselkäkipuun (LBP)2,3. de Roos ym.4 ja Modic ym.5 kuvasivat itsenäisesti ensimmäiset kolme erilaista subkondraalista signaalipoikkeavuutta nikamaluuytimessä. Modiset tyypin I muutokset ovat hypointensiivisiä T1-painotetuissa (T1W) sekvensseissä ja hyperintensiivisiä T2-painotetuissa (T2W) sekvensseissä. Tämä leesio paljastaa fissuurapäätelevyjä ja viereisen verisuonten granulaatiokudoksen luuytimessä. Modiset tyypin II muutokset osoittavat voimakasta signaalia sekä T1W- että T2W-sekvensseissä. Tämän tyyppisessä leesiossa voidaan havaita päätelevyn tuhoutumista sekä viereisen luuytimen histologista rasvaista korvautumista. Modiset tyypin III muutokset osoittavat heikkoa signaalia T1W- ja T2W-sekvensseissä. Päätylevyjä vastaavia skleroottisia leesioita on havaittu6. MC:tä pidetään selkärangan patologisena sairautena, ja se liittyy läheisesti moniin selkärangan degeneratiivisiin sairauksiin7,8,9.
Saatavilla olevan tiedon perusteella useat tutkimukset ovat antaneet yksityiskohtaista tietoa MC:n etiologiasta ja patologisista mekanismeista. Albert ym. ehdottivat, että MC:n voi aiheuttaa välilevyn tyrä8. Hu ym. selittävät MC:n vakavalla välilevyn rappeumalla10. Kroc esitti "sisäisen välilevyn repeämän" käsitteen, jonka mukaan toistuvat välilevyn traumat voivat johtaa mikrorepeämiin päätylevyssä. Halkion muodostumisen jälkeen päätylevyn tuhoutuminen nucleus pulposuksen (NP) avulla voi laukaista autoimmuunivasteen, joka johtaa edelleen MC11:n kehittymiseen. Ma ym. jakoivat samanlaisen näkemyksen ja raportoivat, että NP:n aiheuttamalla autoimmuunisuudella on keskeinen rooli MC12:n patogeneesissä.
Immuunijärjestelmän soluilla, erityisesti CD4+ T-auttajasoluilla, on ratkaiseva rooli autoimmuniteetin patogeneesissä13. Äskettäin löydetty Th17-alaryhmä tuottaa tulehdusta edistävää sytokiinia IL-17, edistää kemokiinien ilmentymistä ja stimuloi vaurioituneiden elinten T-soluja tuottamaan IFN-γ14. Myös Th2-soluilla on ainutlaatuinen rooli immuunivasteiden patogeneesissä. IL-4:n ilmentyminen tyypillisenä Th2-soluna voi johtaa vakaviin immunopatologisiin seurauksiin15.
Vaikka MC:stä on tehty useita kliinisiä tutkimuksia16,17,18,19,20,21,22,23,24, sopivia eläinkoemalleja, jotka voisivat jäljitellä ihmisillä usein esiintyvää MC-prosessia ja joita voitaisiin käyttää etiologian tai uusien hoitojen, kuten kohdennetun terapian, tutkimiseen, ei vieläkään ole. Tähän mennessä on raportoitu vain muutamia MC:n eläinmalleja, jotka tutkivat taustalla olevia patologisia mekanismeja.
Albertin ja Man ehdottaman autoimmuuniteorian pohjalta tässä tutkimuksessa luotiin yksinkertainen ja toistettavissa oleva kaniinin MC-malli siirtämällä NP autoimplantaation avulla lähelle porattua nikaman päätylevyä. Muita tavoitteita ovat eläinmallien histologisten ominaisuuksien tarkkailu ja NP:n erityisten mekanismien arviointi MC:n kehittymisessä. Tätä varten käytämme tekniikoita, kuten molekyylibiologiaa, magneettikuvausta ja histologisia tutkimuksia, tutkiaksemme MC:n etenemistä.
Kaksi kania kuoli verenvuotoon leikkauksen aikana ja neljä kania kuoli nukutuksen aikana magneettikuvauksen aikana. Loput 48 kania selvisivät hengissä eivätkä osoittaneet käyttäytymis- tai neurologisia oireita leikkauksen jälkeen.
Magneettikuvauksessa eri reikiin upotetun kudoksen signaalin intensiteetti on erilainen. NPE-ryhmän L5-nikaman signaalin intensiteetti muuttui vähitellen 12, 16 ja 20 viikon kuluttua asettamisesta (T1W-sekvenssi osoitti heikkoa signaalia ja T2W-sekvenssi sekamuotoista signaalia ja heikkoa signaalia) (kuva 1C), kun taas kahden muun upotettujen osien ryhmän magneettikuvaus pysyi suhteellisen vakaana samana aikana (kuva 1A, B).
(A) Kaniinin lannerangan edustavat peräkkäiset magneettikuvaukset kolmena eri aikapisteenä. Valeleikkausryhmän kuvissa ei havaittu signaalipoikkeavuuksia. (B) Nikaman signaaliominaisuudet ME-ryhmässä ovat samankaltaiset kuin valeleikkausryhmässä, eikä upotuskohdassa havaita merkittäviä signaalimuutoksia ajan kuluessa. (C) NPE-ryhmässä matala signaali näkyy selvästi T1W-sekvenssissä, ja sekasignaali ja matala signaali näkyvät selvästi T2W-sekvenssissä. 12 viikon ja 20 viikon jaksosta T2W-sekvenssin matalia signaaleja ympäröivät satunnaiset korkeat signaalit vähenevät.
NPE-ryhmässä nikaman kiinnityskohdassa voidaan havaita selvää luun hyperplasiaa, ja luun hyperplasia tapahtuu nopeammin 12–20 viikon välillä (kuva 2C) verrattuna NPE-ryhmään. Mallinnetuissa nikamissa ei havaita merkittävää muutosta; valeryhmä ja ME-ryhmä (kuva 2C) 2A,B).
(A) Nikaman pinta implantoidulla alueella on erittäin sileä, reikä paranee hyvin eikä nikamarungossa ole hyperplasiaa. (B) Implantaatiokohdan muoto ME-ryhmässä on samanlainen kuin lumeleikkausryhmässä, eikä implantaatiokohdan ulkonäössä ole havaittavissa selviä muutoksia ajan kuluessa. (C) NPE-ryhmässä implantaatiokohdassa esiintyi luun hyperplasiaa. Luun hyperplasia lisääntyi nopeasti ja ulottui jopa nikamien välisen välilevyn läpi vastakkaiseen nikamaan.
Histologinen analyysi antaa yksityiskohtaisempaa tietoa luunmuodostuksesta. Kuva 3 esittää H&E-värjätyistä leikkauksen jälkeisistä leikkeistä otettuja valokuvia. Valeleikkausryhmässä kondrosyytit olivat hyvin järjestäytyneet eikä solujen lisääntymistä havaittu (kuva 3A). Tilanne ME-ryhmässä oli samanlainen kuin valeleikkausryhmässä (kuva 3B). NPE-ryhmässä havaittiin kuitenkin suuri määrä kondrosyyttejä ja NP-tyyppisten solujen lisääntymistä implantaatiokohdassa (kuva 3C);
(A) Trabekuloita voidaan nähdä lähellä päätylevyä, kondrosyytit ovat siististi järjestäytyneet, solukoko ja -muoto ovat tasaiset eikä niissä ole lisääntymistä (40 kertaa). (B) Implantaatiokohdan tila ME-ryhmässä on samanlainen kuin valeryhmässä. Trabekuloita ja kondrosyyttejä voidaan nähdä, mutta implantaatiokohdassa ei ole selvää lisääntymistä (40 kertaa). (B) Voidaan nähdä, että kondrosyytit ja NP:n kaltaiset solut lisääntyvät merkittävästi, ja kondrosyyttien muoto ja koko ovat epätasaiset (40 kertaa).
Interleukiini 4:n (IL-4) mRNA:n, interleukiini 17:n (IL-17) mRNA:n ja interferoni γ:n (IFN-γ) mRNA:n ilmentymistä havaittiin sekä NPE- että ME-ryhmissä. Kun kohdegeenien ilmentymistasoja verrattiin, IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n geenien ilmentymiset olivat merkitsevästi lisääntyneet NPE-ryhmässä verrattuna ME-ryhmään ja lumeleikkausryhmään (kuva 4) (P < 0,05). Verrattuna lumeleikkausryhmään IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n ilmentymistasot ME-ryhmässä lisääntyivät vain hieman eivätkä saavuttaneet tilastollista muutosta (P > 0,05).
IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n mRNA:n ilmentyminen NPE-ryhmässä osoitti merkittävästi korkeampaa trendiä kuin lumeleikkausryhmässä ja ME-ryhmässä (P < 0,05).
Sitä vastoin ME-ryhmän ilmentymistasot eivät osoittaneet merkitsevää eroa (P>0,05).
Western blot -analyysi suoritettiin käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia IL-4- ja IL-17-vasta-aineita muuttuneen mRNA:n ilmentymiskuvion varmistamiseksi. Kuten kuvista 5A ja B käy ilmi, NPE-ryhmän IL-4- ja IL-17-proteiinitasot olivat merkitsevästi kohonneet ME-ryhmään ja lumeleikkausryhmään verrattuna (P < 0,05). Valeleikkausryhmään verrattuna ME-ryhmän IL-4- ja IL-17-proteiinitasot eivät myöskään saavuttaneet tilastollisesti merkitseviä muutoksia (P > 0,05).
(A) IL-4- ja IL-17-proteiinitasot NPE-ryhmässä olivat merkitsevästi korkeammat kuin ME-ryhmässä ja lumelääkeryhmässä (P < 0,05). (B) Western blot -histogrammi.
Koska leikkauksen aikana saatujen ihmisnäytteiden määrä on rajallinen, selkeiden ja yksityiskohtaisten tutkimusten tekeminen MC:n patogeneesistä on jonkin verran vaikeaa. Pyrimme luomaan MC:n eläinmallin tutkiaksemme sen mahdollisia patologisia mekanismeja. Samanaikaisesti radiologista arviointia, histologista arviointia ja molekyylibiologista arviointia käytettiin NP-autograftin aiheuttaman MC:n kulun seuraamiseen. Tämän seurauksena NP-implantaatiomalli johti signaalin intensiteetin asteittaiseen muutokseen 12 viikon ja 20 viikon aikapisteiden välillä (sekoitus matala signaali T1W-sekvensseissä ja matala signaali T2W-sekvensseissä), mikä viittaa kudosmuutoksiin, ja histologiset ja molekyylibiologiset arvioinnit vahvistivat radiologisen tutkimuksen tulokset.
Tämän kokeen tulokset osoittavat, että NPE-ryhmässä nikamien rikkoutumiskohdassa havaittiin visuaalisia ja histologisia muutoksia. Samanaikaisesti havaittiin IL-4-, IL-17- ja IFN-γ-geenien sekä IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että autologisen nucleus pulposus -kudoksen vaurioituminen nikamassa voi aiheuttaa useita signaali- ja morfologisia muutoksia. On helppo havaita, että eläinmallin nikamien signaaliominaisuudet (heikko signaali T1W-sekvenssissä, sekasignaali ja heikko signaali T2W-sekvenssissä) ovat hyvin samankaltaisia kuin ihmisen nikamasolujen, ja magneettikuvausominaisuudet vahvistavat myös histologian ja makroskooppisen anatomian havainnot, eli nikamasolujen muutokset ovat eteneviä. Vaikka akuutin trauman aiheuttama tulehdusvaste voi ilmetä pian punktion jälkeen, magneettikuvaustulokset osoittivat, että asteittain kasvavat signaalimuutokset ilmenivät 12 viikkoa punktion jälkeen ja kestivät jopa 20 viikkoa ilman merkkejä toipumisesta tai magneettikuvausmuutosten korjaantumisesta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että autologinen nikamien NP on luotettava menetelmä progressiivisen MV:n aikaansaamiseksi kaneilla.
Tämä punktiomalli vaatii riittävästi taitoa, aikaa ja kirurgista vaivaa. Alustavissa kokeissa paravertebraalisten nivelsiteiden dissektio tai liiallinen stimulaatio voi johtaa nikamaosteofyyttien muodostumiseen. On varottava vahingoittamasta tai ärsyttämästä viereisiä välilevyjä. Koska tunkeutumissyvyyttä on kontrolloitava johdonmukaisten ja toistettavien tulosten saamiseksi, teimme manuaalisesti tulpan leikkaamalla pois 3 mm pitkän neulan suojuksen. Tämän tulpan käyttö varmistaa tasaisen poraussyvyyden nikamaan. Alustavissa kokeissa kolme leikkaukseen osallistunutta ortopedikirurgia havaitsi, että 16-kaliiperisten neulojen kanssa oli helpompi työskennellä kuin 18-kaliiperisten neulojen tai muiden menetelmien kanssa. Liiallisen verenvuodon välttämiseksi porauksen aikana neulan pitäminen paikallaan jonkin aikaa tarjoaa sopivamman asetusreiän, mikä viittaa siihen, että tiettyä MC:n määrää voidaan kontrolloida tällä tavalla.
Vaikka monet tutkimukset ovat kohdistuneet MC:hen, MC:n etiologiasta ja patogeneesistä tiedetään vain vähän25,26,27. Aiempien tutkimuksiemme perusteella havaitsimme, että autoimmuniteetilla on keskeinen rooli MC12:n esiintymisessä ja kehittymisessä. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n kvantitatiivista ilmentymistä, jotka ovat CD4+-solujen tärkeimmät erilaistumisreitit antigeenistimulaation jälkeen. Tutkimuksessamme NPE-ryhmällä oli korkeampi IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n ilmentyminen verrattuna negatiiviseen ryhmään, ja myös IL-4:n ja IL-17:n proteiinitasot olivat korkeammat.
Kliinisesti IL-17-mRNA:n ilmentyminen on lisääntynyt NP-soluissa potilailla, joilla on välilevytyrä28. Myös IL-4:n ja IFN-γ:n ilmentymistasojen nousua havaittiin akuutissa ei-kompressoivassa välilevytyrämallissa verrattuna terveisiin verrokkeihin29. IL-17:llä on keskeinen rooli tulehduksessa ja kudosvaurioissa autoimmuunisairauksissa30, ja se tehostaa immuunivastetta IFN-γ:lle31. Lisääntynyttä IL-17:n välittämää kudosvauriota on raportoitu MRL/lpr-hiirillä32 ja autoimmuniteetille alttiilla hiirillä33. IL-4 voi estää tulehdusta edistävien sytokiinien (kuten IL-1β:n ja TNFα:n) ilmentymistä ja makrofagien aktivaatiota34. Raportoitiin, että IL-4:n mRNA:n ilmentyminen oli erilaista NPE-ryhmässä verrattuna IL-17:ään ja IFN-γ:ään samaan aikaan; IFN-γ:n mRNA:n ilmentyminen NPE-ryhmässä oli merkittävästi korkeampi kuin muissa ryhmissä. Siksi IFN-γ:n tuotanto voi olla NP-interkalaation aiheuttaman tulehdusvasteen välittäjä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että IFN-γ:tä tuottavat useat solutyypit, mukaan lukien aktivoituneet tyypin 1 auttaja-T-solut, luonnolliset tappajasolut ja makrofagit35,36, ja se on keskeinen tulehdusta edistävä sytokiini, joka edistää immuunivasteita37.
Tämä tutkimus viittaa siihen, että autoimmuunivaste saattaa olla osallisena MC:n esiintymisessä ja kehittymisessä. Luoma ym. havaitsivat, että MC:n ja näkyvän NP:n signaaliominaisuudet ovat samankaltaisia magneettikuvauksessa, ja molemmat osoittavat voimakasta signaalia T2W-sekvenssissä38. Joidenkin sytokiinien, kuten IL-139:n, on vahvistettu liittyvän läheisesti MC:n esiintymiseen. Ma ym. ehdottivat, että NP:n ylöspäin tai alaspäin suuntautuvalla ulkonemalla voi olla suuri vaikutus MC12:n esiintymiseen ja kehittymiseen. Bobechko40 ja Herzbein ym.41 raportoivat, että NP on immunotolerantti kudos, joka ei voi päästä verenkiertoon syntymästä lähtien. NP:n ulkonemat tuovat vieraita esineitä verenkiertoon, mikä välittää paikallisia autoimmuunireaktioita42. Autoimmuunireaktiot voivat indusoida suuren määrän immuunitekijöitä, ja kun nämä tekijät altistuvat jatkuvasti kudoksille, ne voivat aiheuttaa muutoksia signaloinnissa43. Tässä tutkimuksessa IL-4:n, IL-17:n ja IFN-γ:n yliekspressio ovat tyypillisiä immuunitekijöitä, mikä todistaa edelleen NP:n ja MC:iden välisen läheisen suhteen44. Tämä eläinmalli jäljittelee hyvin NP:n läpimurtoa ja pääsyä päätylevyyn. Tämä prosessi paljasti edelleen autoimmuniteetin vaikutuksen MC:hen.
Kuten odotettua, tämä eläinmalli tarjoaa meille mahdollisen alustan MC:n tutkimiseen. Mallilla on kuitenkin edelleen joitakin rajoituksia: ensinnäkin eläinten havainnointivaiheessa jotkut keskivaiheen kanit on lopetettava histologisia ja molekyylibiologisia testejä varten, joten jotkut eläimet "jäävät pois käytöstä" ajan myötä. Toiseksi, vaikka tässä tutkimuksessa asetetaan kolme ajankohtaa, valitettavasti mallinsimme vain yhtä MC-tyyppiä (Modic-tyypin I muutos), joten se ei riitä edustamaan ihmisen sairauden kehitysprosessia, ja useampia ajankohtaisia on asetettava, jotta kaikkia signaalimuutoksia voidaan havaita paremmin. Kolmanneksi, kudosrakenteen muutokset voidaan todellakin osoittaa selvästi histologisella värjäyksellä, mutta jotkut erikoistekniikat voivat paremmin paljastaa mikrorakenteelliset muutokset tässä mallissa. Esimerkiksi polarisoitua valomikroskopiaa käytettiin analysoimaan fibroruston muodostumista kaniinin nikamien välilevyissä45. NP:n pitkäaikaiset vaikutukset MC:hen ja päätylevyyn vaativat lisätutkimuksia.
Viisikymmentäneljä urospuolista Uuden-Seelannin valkoista kania (paino noin 2,5–3 kg, ikä 3–3,5 kuukautta) jaettiin satunnaisesti lumeleikkausryhmään, lihasimplantaatioryhmään (ME-ryhmä) ja hermojuuriimplantaatioryhmään (NPE-ryhmä). Tianjinin sairaalan eettinen toimikunta hyväksyi kaikki kokeelliset menetelmät, ja kokeelliset menetelmät suoritettiin tiukasti hyväksyttyjen ohjeiden mukaisesti.
S. Sobajiman kirurgiseen tekniikkaan on tehty joitakin parannuksia46. Jokainen kani asetettiin kylkimakuuasentoon ja viiden peräkkäisen lannevälilevyn etupinta paljastettiin posterolateraalisesti retroperitoneaalisesti. Jokaiselle kanille annettiin yleisanestesia (20 % uretaania, 5 ml/kg korvan laskimoon). Kylkiluiden alareunasta lantion reunaan tehtiin pitkittäinen ihoviillon suuntainen iho, 2 cm vatsapuolelle paravertebraalisista lihaksista. Oikea anterolateraalinen selkäranka L1:stä L6:een paljastettiin terävällä ja tylpällä leikkauksella päällä olevasta ihonalaisesta kudoksesta, retroperitoneaalisesta kudoksesta ja lihaksista (kuva 6A). Välilevyn taso määritettiin käyttämällä lantion reunaa anatomisena maamerkkinä L5-L6-välilevyn tasolle. Poraa 16-kaliiperisella punktoneulalla reikä L5-nikaman päätylevyn lähelle 3 mm syvyyteen (kuva 6B). Käytä 5 ml:n ruiskua L1-L2-nikamien välilevystä (kuva 6C) autologisen nucleus pulposuksen imemiseen. Poista nucleus pulposus tai lihas kunkin ryhmän vaatimusten mukaisesti. Kun porareikä on syvennetty, syvään faskiaan, pinnalliseen faskiaan ja ihoon asetetaan imeytyvät ompeleet varoen vahingoittamasta nikaman luukalvokudosta leikkauksen aikana.
(A) L5–L6-välilevy paljastetaan posterolateraalisella retroperitoneaalisella lähestymistavalla. (B) Poraa 16-kaliiperisella neulalla reikä lähelle L5:n päätylevyä. (C) Autologiset MF:t kerätään.
Yleisanestesia annettiin 20-prosenttisella uretaanilla (5 ml/kg) korvan laskimoon, ja lannerangan röntgenkuvat toistettiin 12, 16 ja 20 viikolla leikkauksen jälkeen.
Kanit lopetettiin antamalla niille lihaksensisäisesti ketamiinia (25,0 mg/kg) ja laskimonsisäisesti natriumpentobarbitaalia (1,2 g/kg) 12, 16 ja 20 viikkoa leikkauksen jälkeen. Koko selkäranka poistettiin histologista analyysia varten ja suoritettiin varsinainen analyysi. Immuunitekijöiden muutosten havaitsemiseksi käytettiin kvantitatiivista käänteiskopiointia (RT-qPCR) ja Western-blottausta.
Kaneille tehtiin magneettikuvaus käyttäen 3,0 T kliinistä magneettia (GE Medical Systems, Florence, SC), joka oli varustettu ortogonaalisella raajakelan vastaanottimella. Kanit nukutettiin 20 % uretaanilla (5 ml/kg) korvalaskimon kautta ja asetettiin sitten selinmakuulle magneetin sisään lannealueen keskitettynä 5 tuuman halkaisijaltaan olevaan pyöreään pintakelaan (GE Medical Systems). Koronaalisilla T2-painotetuilla lokalisaattorikuvilla (TR, 1445 ms; TE, 37 ms) määritettiin lannevälilevyn sijainti L3–L4:stä L5–L6:een. Sagittaalitasossa otettiin T2-painotetut viipaleet seuraavilla asetuksilla: nopea spin-kaikusekvenssi, jonka toistoaika (TR) oli 2200 ms ja kaikuaika (TE) 70 ms, matriisi; näkökenttä 260 ja kahdeksan ärsykettä; leikkauspaksuus oli 2 mm, rako oli 0,2 mm.
Kun viimeinen valokuva oli otettu ja viimeinen kaniini tapettu, vale-, lihakseen upotetut ja NP-levyt poistettiin histologista tutkimusta varten. Kudokset kiinnitettiin 10 % neutraalissa puskuroidussa formaliinissa yhden viikon ajan, niistä poistettiin kalkki etyleenidiamiinitetraetikkahapolla ja parafiinileikkeet tehtiin. Kudosblokit upotettiin parafiiniin ja leikattiin sagittaalisiksi leikkeiksi (5 μm paksuisiksi) mikrotomilla. Leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E).
Kun kunkin ryhmän kaniinien nikamien välilevyt oli kerätty, kokonais-RNA uutettiin UNIQ-10-kolonnilla (Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd., Kiina) valmistajan ohjeiden mukaisesti ja ImProm II -käänteiskopiointijärjestelmällä (Promega Inc., Madison, WI, USA). Käänteiskopiointi suoritettiin.
RT-qPCR suoritettiin käyttäen Prism 7300 -laitetta (Applied Biosystems Inc., USA) ja SYBR Green Jump Start Taq ReadyMixiä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-reaktion tilavuus oli 20 μl ja se sisälsi 1,5 μl laimennettua cDNA:ta ja 0,2 μM kutakin aluketta. Alukkeet suunnitteli OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) ja valmisti Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (Kiina) (taulukko 1). Käytettiin seuraavia lämpösykliolosuhteita: aluksi polymeraasin aktivaatiovaihe 94 °C:ssa 2 minuutin ajan, sitten 40 sykliä, kukin 15 sekunnin ajan 94 °C:ssa templaatin denaturointia varten, hehkutus 1 minuutin ajan 60 °C:ssa, ekstensio ja fluoresenssi. Mittaukset tehtiin 1 minuutin ajan 72 °C:ssa. Kaikki näytteet monistettiin kolme kertaa ja keskiarvoa käytettiin RT-qPCR-analyysiin. Monistustiedot analysoitiin FlexStation 3 -laitteella (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). IL-4-, IL-17- ja IFN-γ-geenien ilmentyminen normalisoitiin endogeeniseen kontrolliin (ACTB). Kohde-mRNA:n suhteelliset ilmentymistasot laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCT-menetelmää.
Kokonaisproteiini uutettiin kudoksista käyttämällä kudoshomogenisaattoria RIPA-lysispuskurissa (joka sisälsi proteaasi- ja fosfataasi-inhibiittorisekoituksen) ja sentrifugoitiin sitten nopeudella 13 000 rpm 20 minuuttia 4 °C:ssa kudosjätteiden poistamiseksi. Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinia ladattiin kaistaa kohden, eroteltiin 10 % SDS-PAGE:lla ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle. Blokkaus suoritettiin 5 % rasvattomassa maitojauheessa Tris-puskuroituun suolaliuokseen (TBS), joka sisälsi 0,1 % Tween 20:tä, 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Kalvoa inkuboitiin kaniinin anti-dekoriinin primaarisen vasta-aineen (laimennettu 1:200; Boster, Wuhan, Kiina) (laimennettu 1:200; Bioss, Peking, Kiina) kanssa yön yli 4 °C:ssa ja reagoitiin toisena päivänä sekundaarisen vasta-aineen (vuohen anti-kaniini-immunoglobuliini G laimennoksena 1:40 000) ja piparjuuriperoksidaasin (Boster, Wuhan, Kiina) kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Western blot -signaalit havaittiin lisääntyneenä kemiluminesenssina kemiluminesenssina kemiluminesenssikalvolla röntgensäteilyn jälkeen. Densitometristä analyysiä varten blotit skannattiin ja kvantifioitiin BandScan-ohjelmistolla, ja tulokset ilmaistiin kohdegeenin immunoreaktiivisuuden ja tubuliinin immunoreaktiivisuuden suhteena.
Tilastolliset laskelmat tehtiin SPSS16.0-ohjelmistopaketilla (SPSS, USA). Tutkimuksen aikana kerätyt tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (keskiarvo ± SD) ja analysoitiin yksisuuntaisella toistettujen mittausten varianssianalyysillä (ANOVA) ryhmien välisten erojen määrittämiseksi. P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.
Siten MC:n eläinmallin luominen istuttamalla autologisia nanopartikkeleita nikamaan ja suorittamalla makroanatominen havainnointi, MRI-analyysi, histologinen arviointi ja molekyylibiologinen analyysi voi olla tärkeä työkalu ihmisen MC:n mekanismien arvioinnissa ja ymmärtämisessä sekä uusien terapeuttisten interventioiden kehittämisessä.
Artikkelin viittausohjeet: Han, C. ym. Modic-muutosten eläinmalli luotiin istuttamalla autologinen nucleus pulposus lannerangan subkondraaliseen luuhun. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt, D., Zanetti, M., Hodler, J. ja Boos, N. Lannerangan magneettikuvaus: välilevyn tyrän ja pidättymisen, hermojuuren puristumisen, päätylevyn poikkeavuuksien ja fasettinivelen nivelrikon esiintyvyys oireettomilla vapaaehtoisilla. Radiology 209, 661–666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, ja Leboeuf-Eed, K. Modiset muutokset ja niiden suhde kliinisiin löydöksiin. European Spine Journal: European Spine Societyn, European Society of Spinal Deformityn ja European Society for Cervical Spine Researchin virallinen julkaisu 15, 1312–1319, doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
Kuisma, M., ym. Lannerangan nikamien päätylevyjen modaaliset muutokset: esiintyvyys ja yhteys alaselkäkipuun ja iskiakseen keski-ikäisillä miespuolisilla työntekijöillä. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K. ja Dalinka, M. Luuytimen muutosten magneettikuvaus lähellä päätylevyä lannerangan rappeuttavassa sairaudessa. AJR. American Journal of Radiology 149, 531–534, doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic, MT, Steinberg, PM, Ross, JS, Masaryk, TJ ja Carter, JR. Nikamarauhasvaurio: nikamamuutosten arviointi magneettikuvauksella. Radiology 166, 193–199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
Modic, MT, Masaryk, TJ, Ross, JS ja Carter, JR. Degeneratiivisen välilevysairauden kuvantaminen. Radiology 168, 177–186, doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
Jensen, TS, ym. Neovertebraalisen päätelevyn (Modic) signaalimuutosten ennustajat väestössä. European Spine Journal: European Spine Societyn, European Society of Spinal Deformityn ja European Society for Cervical Spine Researchin virallinen julkaisu, Division 19, 129–135, doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
Albert, HB ja Mannisch, K. Modiset muutokset lannevälilevyn tyrän jälkeen. European Spine Journal: European Spine Societyn, European Society of Spinal Deformityn ja European Society for Cervical Spine Researchin virallinen julkaisu 16, 977–982, doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula, L., Luoma, K., Vehmas, T., Gronblad, M., ja Kaapa, E. Modisen tyypin I muutokset voivat ennustaa nopeasti etenevää deformaatiovälilevyn rappeumaa: 1 vuoden prospektiivinen tutkimus. European Spine Journal 21, 1135–1142, doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
Hu, ZJ, Zhao, FD, Fang, XQ ja Fan, SW. Modiset muutokset: mahdolliset syyt ja vaikutus lannevälilevyn rappeumaan. Medical Hypotheses 73, 930–932, doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok, HV Sisäinen välilevyn repeämä. Välilevyn laskeumaongelmat yli 50 vuoden ajan. Spine (Phila Pa 1976) 11, 650–653 (1986).
Julkaisun aika: 13.12.2024