Kiitos käynnistäsi nature.com-sivustolla. Käyttämäsi selainversio tukee CSS:ää rajoitetusti. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään uusinta selainversiota (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi tämä sivusto on vapaa tyyleistä ja JavaScriptistä.
Luustolihas on heterogeeninen kudos, joka koostuu pääasiassa myofibrilleistä, jotka ihmisillä luokitellaan tyypillisesti kolmeen tyyppiin: yksi "hidas" (tyyppi 1) ja kaksi "nopeaa" (tyypit 2A ja 2X). Perinteisten myofibrillityyppien välinen ja sisäinen heterogeenisuus on kuitenkin edelleen huonosti ymmärretty. Sovelsimme transkriptoomista ja proteomiikkaa 1050 ja 1038 yksittäiseen ihmisen vastus lateralis -lihaksen myofibrilliin. Proteomiikkatutkimukseen osallistui miehiä, ja transkriptoomiseen tutkimukseen osallistui 10 miestä ja 2 naista. Myosiinin raskasketjuisoformien lisäksi tunnistimme metabolisia proteiineja, ribosomaalisia proteiineja ja solujen junktioproteiineja moniulotteisen myofibrillien välisen vaihtelun lähteiksi. Lisäksi, vaikka hitaiden ja nopeiden kuitujen klustereita on tunnistettu, datamme viittaa siihen, että tyypin 2X kuidut ovat fenotyyppisesti erottamattomia muista nopeasti nykiytyvistä kuiduista. Lisäksi myosiinin raskasketjuun perustuva luokittelu ei riitä kuvaamaan myofibrillifenotyyppiä nemaliinimyopatioissa. Kaiken kaikkiaan tietomme viittaavat moniulotteiseen myofiberien heterogeenisyyteen, jonka vaihtelun lähteet ulottuvat myosiinin raskasketjuisoformien ulkopuolelle.
Solujen heterogeenisuus on kaikkien biologisten järjestelmien luontainen ominaisuus, jonka ansiosta solut voivat erikoistua vastaamaan kudosten ja solujen erilaisiin tarpeisiin.1 Perinteinen näkemys luustolihasten kuitujen heterogeenisyydestä on ollut, että motoriset neuronit määrittelevät kuitutyypin motorisessa yksikössä ja että kuitutyyppi (eli tyyppi 1, tyyppi 2A ja tyyppi 2X ihmisillä) määräytyy myosiinin raskaan ketjun (MYH) isoformien ominaisuuksien perusteella.2 Tämä perustui alun perin niiden pH-ATPaasi-epästabiilisuuteen,3,4 ja myöhemmin niiden MYH:n molekyyliekspressioon.5 Kuitenkin, kun tunnistettiin ja myöhemmin hyväksyttiin "sekoitettuja" kuituja, jotka ilmentävät useita MYH:ita vaihtelevissa suhteissa, luustolihasten kuituja pidetään yhä enemmän jatkumona pikemminkin kuin erillisinä kuitutyyppeinä.6 Tästä huolimatta ala nojaa edelleen vahvasti MYH:hon ensisijaisena luokittelijana lihaskuitujen luokittelussa. Näkemykseen todennäköisesti vaikuttavat varhaisten jyrsijätutkimusten rajoitukset ja merkittävät vinoumat, joiden MYH:n ilmentymisprofiilit ja kuitutyyppien valikoima eroavat ihmisistä.2 Tilannetta monimutkaistaa entisestään se, että eri ihmisen luustolihaksissa on monipuolinen valikoima kuitutyyppejä.7 Vastus lateralis on sekalihas jolla on keskitason (ja siten edustava) MYH-ilmentymisprofiili.7 Lisäksi sen helppo näytteenotto tekee siitä parhaiten tutkitun lihaksen ihmisillä.
Tästä syystä luustolihassäilien monimuotoisuuden puolueeton tutkiminen tehokkailla "omiikka"-työkaluilla on kriittistä, mutta myös haastavaa, osittain luustolihassäilien monitumaisen luonteen vuoksi. Transkriptomiikka8,9 ja proteomiikka10 -teknologiat ovat kuitenkin kokeneet herkkyyden mullistuksen viime vuosina erilaisten teknologisten edistysaskeleiden ansiosta, jotka mahdollistavat luustolihasten analysoinnin yksittäisten kuitujen resoluutiolla. Tämän seurauksena on edistytty merkittävästi yksittäisten kuitujen monimuotoisuuden ja niiden vasteen atrofisiin ärsykkeisiin ja ikääntymiseen karakterisoinnissa11,12,13,14,15,16,17,18. Tärkeää on, että näillä teknologisilla edistysaskeleilla on kliinisiä sovelluksia, jotka mahdollistavat sairauksiin liittyvän säätelyhäiriön yksityiskohtaisemman ja tarkemman karakterisoinnin. Esimerkiksi nemaliinimyopatian, yhden yleisimmistä perinnöllisistä lihassairauksista (MIM 605355 ja MIM 161800), patofysiologia on monimutkainen ja hämmentävä.19,20 Siksi luustolihassäilien säätelyhäiriön parempi karakterisointi voisi johtaa merkittäviin edistysaskeliin tämän sairauden ymmärtämisessä.
Kehitimme menetelmiä yksittäisten luustolihassyiden transkriptoomiseen ja proteomiseen analyysiin, jotka eristettiin manuaalisesti ihmisen biopsianäytteistä, ja sovelsimme niitä tuhansiin syihin, mikä mahdollisti ihmisen luustolihassyiden soluheterogeenisyyden tutkimisen. Tämän työn aikana osoitimme lihassyiden transkriptomisen ja proteomisen fenotyypityksen tehokkuuden ja tunnistimme metaboliset, ribosomaaliset ja solujen junktioproteiinit merkittäviksi syiden välisen vaihtelun lähteiksi. Lisäksi tätä proteomiikkatyönkulkua käyttämällä karakterisoimme sukkulamatomyopatian kliinistä merkitystä yksittäisissä luustolihassyissä ja paljastimme koordinoidun siirtymän kohti ei-oksidatiivisia kuituja riippumatta MYH:n perusteella määritetystä kuitutyypistä.
Ihmisen luustolihassyiden heterogeenisyyden tutkimiseksi kehitimme kaksi työnkulkua yksittäisten luustolihassyiden transkriptomi- ja proteomianalyysin mahdollistamiseksi (kuva 1A ja lisäkuva 1A). Kehitimme ja optimoimme useita metodologisia vaiheita näytteen säilytyksestä ja RNA:n ja proteiinin eheyden säilyttämisestä kunkin lähestymistavan läpimenon optimointiin. Transkriptomianalyysissä tämä saavutettiin lisäämällä näytekohtaisia molekyyliviivakoodeja käänteiskopioinnin alkuvaiheeseen, jolloin 96 kuitua voitiin yhdistää tehokasta jatkokäsittelyä varten. Syvempi sekvensointi (±1 miljoona lukua kuitua kohden) verrattuna perinteisiin yksisolumenetelmiin rikastutti transkriptomidataa entisestään.21 Proteomiikassa käytimme lyhyttä kromatografista gradienttia (21 minuuttia) yhdistettynä DIA-PASEF-tiedonkeruuseen timsTOF-massaspektrometrillä proteomisyvyyden optimoimiseksi samalla kun säilytimme korkean läpimenon.22,23 Terveiden luustolihassyiden heterogeenisyyden tutkimiseksi karakterisoimme 14 terveeltä aikuiselta luovuttajalta peräisin olevan 1 050 yksittäisen kuidun transkriptomit ja 5 terveeltä aikuiselta luovuttajalta peräisin olevan 1 038 kuidun proteomit (lisätaulukko 1). Tässä artikkelissa näitä tietojoukkoja kutsutaan vastaavasti 1 000 kuidun transkriptoomiksi ja proteomeiksi. Lähestymistapamme havaitsi yhteensä 27 237 transkriptia ja 2 983 proteiinia 1 000 kuidun transkriptoomi- ja proteomiikka-analyyseissä (kuva 1A, lisäaineistot 1–2). Kun transkriptoomiset ja proteomiikka-aineistot oli suodatettu yli 1 000 havaitun geenin ja 50 %:n validien arvojen osalta kuitua kohden, suoritettiin seuraavat bioinformaattiset analyysit 925 ja 974 kuidulle transkriptomissa ja proteomissa. Suodatuksen jälkeen havaittiin keskimäärin 4257 ± 1557 geeniä ja 2015 ± 234 proteiinia (keskiarvo ± keskihajonta) kuitua kohden, ja yksilöiden välinen vaihtelu oli vähäistä (lisäkuvat 1B–C, lisäaineistot 3–4). Yksilön sisäinen vaihtelu oli kuitenkin selvempää osallistujien välillä, mikä johtui todennäköisesti RNA/proteiinisaannon eroista eri pituisten ja poikkileikkauspinta-alojen omaavien kuitujen välillä. Useimpien proteiinien (>2000) variaatiokerroin oli alle 20 % (lisäkuva 1D). Molemmat menetelmät mahdollistivat laajan dynaamisen alueen transkriptien ja proteiinien taltioinnin, joilla oli lihasten supistumiselle tärkeitä, voimakkaasti ilmentyviä signatuureja (esim. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (lisäkuvat 1E–F). Useimmat tunnistetuista ominaisuuksista olivat yhteisiä transkriptoomisten ja proteomiikka-aineistojen välillä (lisäkuva 1G), ja näiden ominaisuuksien keskimääräiset UMI/LFQ-intensiteetit korreloivat kohtuullisen hyvin (r = 0,52) (lisäkuva 1H).
Transkriptomiikka- ja proteomiikkatyönkulku (luotu BioRender.comilla). BD Dynaamiset aluekäyrät MYH7:lle, MYH2:lle ja MYH1:lle sekä lasketut kynnysarvot kuitutyypin määritykselle. E, F MYH:n ilmentymisen jakauma kuitujen kesken transkriptomiikka- ja proteomiikka-aineistoissa. G, H Transkriptomiikka- ja proteomiikka-aineistojen UMAP-kuvaajat (Uniform Diversity Approximation and Projection) väritettynä MYH-pohjaisen kuitutyypin mukaan. I, J Ominaisuuskuvaajat, jotka näyttävät MYH7:n, MYH2:n ja MYH1:n ilmentymisen transkriptomiikka- ja proteomiikka-aineistoissa.
Aluksi pyrimme määrittämään kullekin kuidulle MYH-pohjaisen kuitutyypin käyttämällä optimoitua lähestymistapaa, joka hyödyntää MYH-ilmentymisen korkeaa herkkyyttä ja dynaamista aluetta omiikka-aineistoissa. Aiemmissa tutkimuksissa on käytetty mielivaltaisia kynnysarvoja kuitujen merkitsemiseen puhtaaksi tyypiksi 1, tyypiksi 2A, tyypiksi 2X tai sekoitetuiksi eri MYH-molekyylien ilmentymisprosenttien perusteella11,14,24. Käytimme erilaista lähestymistapaa, jossa kunkin kuidun ilmentyminen luokiteltiin niiden tyypittämiseen käyttämiemme MYH-molekyylien perusteella: MYH7, MYH2 ja MYH1, jotka vastaavat tyypin 1, tyypin 2A ja tyypin 2X kuituja. Sitten laskimme matemaattisesti kunkin tuloksena olevan käyrän alemman käännepisteen ja käytimme sitä kynnysarvona kuitujen luokittelemiseksi positiivisiksi (kynnysarvon yläpuolella) tai negatiivisiksi (kynnysarvon alapuolella) kullekin MYH-molekyylille (kuva 1B–D). Nämä tiedot osoittavat, että MYH7:llä (kuva 1B) ja MYH2:lla (kuva 1C) on selkeämmät on/off-ilmentymisprofiilit RNA-tasolla verrattuna proteiinitasoon. Proteiinitasolla todellakin hyvin harvat kuidut eivät ilmentäneet MYH7:ää, eikä missään kuidussa ilmentynyt 100 % MYH2:ta. Seuraavaksi käytimme ennalta määrättyjä ilmentymiskynnysarvoja määrittääksemme MYH-pohjaiset kuitutyypit kaikille kuiduille kussakin tietojoukossa. Esimerkiksi MYH7+/MYH2-/MYH1- kuidut luokiteltiin tyypille 1, kun taas MYH7-/MYH2+/MYH1+ kuidut luokiteltiin sekatyyppiin 2A/2X (katso täydellinen kuvaus lisätaulukosta 2). Yhdistämällä kaikki kuidut havaitsimme huomattavan samanlaisen MYH-pohjaisten kuitutyyppien jakauman sekä RNA- (kuva 1E) että proteiinitasolla (kuva 1F), kun taas MYH-pohjaisten kuitutyyppien suhteellinen koostumus vaihteli odotetusti yksilöiden välillä (lisäkuva 2A). Useimmat kuidut luokiteltiin joko puhtaaksi tyypiksi 1 (34–35 %) tai tyypiksi 2A (36–38 %), vaikka havaittiin myös merkittävä määrä sekatyyppisiä 2A/2X-kuituja (16–19 %). Silmiinpistävä ero on, että puhtaita tyypin 2X-säikeitä voitiin havaita vain RNA-tasolla, mutta ei proteiinitasolla, mikä viittaa siihen, että MYH:n nopea ilmentyminen on ainakin osittain säädeltyä transkription jälkeen.
Validoimme proteomiikkaan perustuvan MYH-säikeiden tyypitysmenetelmämme vasta-ainepohjaisella dot blottingilla, ja molemmat menetelmät saavuttivat 100 %:n yhteensopivuuden puhtaiden tyypin 1 ja tyypin 2A kuitujen tunnistamisessa (katso lisäkuva 2B). Proteomiikkaan perustuva lähestymistapa oli kuitenkin herkempi ja tehokkaampi sekalaisten kuitujen tunnistamisessa ja kunkin MYH-geenin osuuden kvantifioinnissa kussakin kuidussa. Nämä tiedot osoittavat objektiivisen, erittäin herkän omiikkaan perustuvan lähestymistavan tehokkuuden luustolihassäilötyyppien karakterisoinnissa.
Käytimme sitten transkriptomiikan ja proteomiikan yhdistettyä tietoa lihaskuitujen objektiiviseen luokitteluun niiden täydellisen transkriptomin tai proteomin perusteella. Käyttämällä UMAP-menetelmää (uniform manifold approksimaatio ja projektio) dimensionaalisuuden supistamiseksi kuuteen pääkomponenttiin (lisäkuvat 3A–B) pystyimme visualisoimaan lihaskuitujen vaihtelun transkriptomissa (kuva 1G) ja proteomissa (kuva 1H). Huomionarvoista oli, että lihaskuituja ei ryhmitelty osallistujien (lisäkuvat 3C–D) tai testauspäivien (lisäkuva 3E) mukaan transkriptomiikka- tai proteomiikkatietojoukoissa, mikä viittaa siihen, että luustolihaskuitujen yksilöllinen vaihtelu on suurempaa kuin yksilöiden välinen vaihtelu. UMAP-kuvaajassa havaittiin kaksi erillistä klusteria, jotka edustavat "nopeita" ja "hitaita" lihaskuituja (kuvat 1G–H). MYH7+ (hitaat) lihaskuidut ryhmittyivät UMAP1:n positiiviseen napaan, kun taas MYH2+ ja MYH1+ (nopeat) lihaskuidut ryhmittyivät UMAP1:n negatiiviseen napaan (kuvat 1I–J). Nopeasti supistuvien kuitutyyppien (eli tyypin 2A, tyypin 2X tai sekamuotoisten 2A/2X) välillä ei kuitenkaan tehty eroa MYH:n ilmentymisen perusteella, mikä viittaa siihen, että MYH1:n (kuva 1I–J) tai muiden klassisten 2X-lihaskuitumerkkien, kuten ACTN3:n tai MYLK2:n (lisäkuvat 4A–B), ilmentyminen ei tee eroa eri lihaskuitutyyppien välillä, kun tarkastellaan koko transkriptomia tai proteomia. Lisäksi verrattuna MYH2:een ja MYH7:ään, vain harvat transkriptit tai proteiinit korreloivat positiivisesti MYH1:n kanssa (lisäkuvat 4C–H), mikä viittaa siihen, että MYH1:n runsaus ei täysin heijasta lihaskuitutranskriptomia/proteomia. Samankaltaisiin johtopäätöksiin päädyttiin arvioitaessa kolmen MYH-isoformin sekaekspressiota UMAP-tasolla (lisäkuvat 4I–J). Näin ollen, vaikka 2X-säikeet voidaan tunnistaa transkriptitasolla pelkästään MYH-kvantifioinnin perusteella, MYH1+-säikeitä ei voida erottaa muista nopeista säikeistä, kun tarkastellaan koko transkriptomia tai proteomia.
Alustavana selvityksenä hitaan säikeen heterogeenisyydestä MYH:n ulkopuolella arvioimme neljää vakiintunutta hitaan säikeen tyyppispesifistä proteiinia: TPM3, TNNT1, MYL3 ja ATP2A22. Hitaan säikeen alatyypit osoittivat korkeita, vaikkakaan eivät täydellisiä, Pearsonin korrelaatioita MYH7:n kanssa sekä transkriptomiikassa (lisäkuva 5A) että proteomiikassa (lisäkuva 5B). Noin 25 % ja 33 % hitaista säikeistä ei luokiteltu puhtaiksi hitaiksi säikeiksi kaikkien geeni-/proteiinialatyyppien perusteella transkriptomiikassa (lisäkuva 5C) ja proteomiikassa (lisäkuva 5D). Siksi useisiin geeni-/proteiinialatyyppeihin perustuva hitaan säikeen luokittelu tuo lisää monimutkaisuutta jopa proteiineille, joiden tiedetään olevan säikeen tyyppispesifisiä. Tämä viittaa siihen, että yhden geeni-/proteiiniperheen isoformeihin perustuva säikeiden luokittelu ei välttämättä heijasta riittävästi luustolihassäikeiden todellista heterogeenisyyttä.
Jotta voisimme tutkia tarkemmin ihmisen luustolihassäiöiden fenotyyppistä vaihtelua koko omiikkamallin mittakaavassa, suoritimme datalle harhattoman dimensionaalisuuden reduktion käyttämällä pääkomponenttianalyysia (PCA) (kuva 2A). Samoin kuin UMAP-kuvaajien tapauksessa, ei osallistuja eikä testauspäivä vaikuttanut säieryhmittymiseen PCA-tasolla (lisäkuvat 6A–C). Molemmissa aineistoissa MYH-pohjainen säietyyppi selitettiin PC2:lla, joka osoitti hitaasti supistuvien tyypin 1 säieryppyjen klusterin ja toisen klusterin, joka sisälsi nopeasti supistuvia tyypin 2A, tyypin 2X ja sekalaisia 2A/2X-säikeitä (kuva 2A). Molemmissa aineistoissa nämä kaksi klusteria yhdisti pieni määrä sekalaisia tyypin 1/2A-säikeitä. Kuten odotettua, PC:n pääajureiden ylirepresentaatioanalyysi vahvisti, että PC2:ta ohjasivat supistumis- ja metaboliset signatuurit (kuva 2B ja lisäkuvat 6D–E, lisäaineistot 5–6). Kaiken kaikkiaan MYH-pohjaisen kuitutyypin havaittiin riittävän selittämään jatkuvaa vaihtelua PC2:lla, lukuun ottamatta niin kutsuttuja 2X-kuituja, jotka jakautuivat koko transkriptomiin nopean klusterin sisällä.
A. Transkriptomi- ja proteomiaineistojen pääkomponenttianalyysin (PCA) kuvaajat, jotka on väritetty MYH:n perusteella säietyypin mukaan. B. Transkripti- ja proteiiniajureiden rikastusanalyysi PC2:ssa ja PC1:ssä. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä clusterProfiler-pakettia ja Benjamini-Hochbergin korjattuja p-arvoja. C, D. PCA-kuvaajat, jotka on värjätty transkriptomia koskevien solujen välisen adheesiogeeniontologian (GO) termien ja proteomia koskevien costameerin GO-termien mukaan. Nuolet edustavat transkripti- ja proteiiniajureita ja niiden suuntia. E, F. Kliinisesti relevanttien ominaisuuksien yhtenäisen moninaisuuden approksimaation ja projektion (UMAP) kuvaajat, jotka osoittavat ilmentymisgradientteja hitaasta/nopeasta säietyypistä riippumatta. G, H. PC2- ja PC1-ajureiden väliset korrelaatiot transkriptomeissa ja proteomeissa.
Yllättäen MYH-pohjainen myosuittyyppi selitti vain toiseksi suurimman vaihtelun asteen (PC2), mikä viittaa siihen, että muut MYH-pohjaiseen myosuittyyppiin (PC1) liittymättömät biologiset tekijät ovat tärkeässä roolissa luustolihassäikeiden heterogeenisyyden säätelyssä. PC1:n tärkeimpien ajureiden ylirepresentaatioanalyysi paljasti, että PC1:n vaihtelun määräytyivät ensisijaisesti transkriptomin solu-soluadheesion ja ribosomipitoisuuden sekä proteomin kostameerien ja ribosomiproteiinien perusteella (kuva 2B ja lisäkuvat 6D–E, lisätietojoukko 7). Luustolihaksissa kostameerit yhdistävät Z-levyn sarkolemmaan ja osallistuvat voimansiirtoon ja signalointiin. 25 Solu-soluadheesion (transkriptomi, kuva 2C) ja kostameerien (proteomi, kuva 2D) ominaisuuksia käyttävät annotoidut PCA-kuvaajat paljastivat voimakkaan vasemmalle siirtymisen PC1:ssä, mikä viittaa siihen, että näitä ominaisuuksia on runsaasti tietyissä säikeissä.
Tarkempi UMAP-tason lihaskuitujen klusteroitumisen tarkastelu paljasti, että useimmissa piirteissä ilmeni lihaskuitutyypistä riippumaton MYH-pohjainen ilmentymisgradientti pikemminkin kuin lihaskuitujen alaklusterikohtainen. Tätä jatkuvuutta havaittiin useissa patologisiin tiloihin liittyvissä geeneissä (kuva 2E), kuten CHCHD10:ssä (neuromuskulaarinen sairaus), SLIT3:ssa (lihashatrofia) ja CTDNEP1:ssä (lihassairaus). Tätä jatkuvuutta havaittiin myös proteomissa, mukaan lukien neurologisiin häiriöihin (UGDH), insuliinisignalointiin (PHIP) ja transkriptioon (HIST1H2AB) liittyvät proteiinit (kuva 2F). Yhdessä nämä tiedot osoittavat jatkuvuutta kuitutyypistä riippumattomassa hitaan/nopean nykimisen heterogeenisyydessä eri lihaskuitujen välillä.
Mielenkiintoista kyllä, PC2:n ajurigeenit osoittivat hyvää transkriptomi-proteomikorrelaatiota (r = 0,663) (kuva 2G), mikä viittaa siihen, että hitaasti ja nopeasti supistuvat kuitutyypit, ja erityisesti luustolihaskuitujen supistumis- ja metaboliset ominaisuudet, ovat transkriptionaalisesti säädeltyjä. PC1:n ajurigeenit eivät kuitenkaan osoittaneet transkriptomi-proteomikorrelaatiota (r = -0,027) (kuva 2H), mikä viittaa siihen, että hitaasti/nopeasti supistuvaan kuitutyyppiin liittymättömät variaatiot säädellään suurelta osin transkriptionaalisesti. Koska PC1:n variaatiot selitettiin pääasiassa ribosomaalisen geeniontologian termeillä ja koska ribosomeilla on ratkaiseva ja erikoistunut rooli solussa osallistumalla aktiivisesti proteiinin translaatioon ja vaikuttamalla siihen,31 ryhdyimme seuraavaksi tutkimaan tätä odottamatonta ribosomien heterogeenisyyttä.
Väritimme ensin proteomiikan pääkomponenttianalyysin kuvaajan GOCC-termin "sytoplasminen ribosomi" proteiinien suhteellisen runsauden mukaan (kuva 3A). Vaikka tämä termi on rikastunut PC1:n positiivisella puolella, mikä johtaa pieneen gradienttiin, ribosomaaliset proteiinit ajavat PC1:n jakautumista molempiin suuntiin (kuva 3A). PC1:n negatiivisella puolella rikastuneita ribosomaalisia proteiineja olivat RPL18, RPS18 ja RPS13 (kuva 3B), kun taas RPL31, RPL35 ja RPL38 (kuva 3C) olivat tärkeimmät PC1:n positiivisen puolen ajurit. Mielenkiintoista on, että RPL38 ja RPS13 ilmentyivät runsaasti luurankolihaksissa verrattuna muihin kudoksiin (lisäkuva 7A). Näitä PC1:n erottuvia ribosomaalisia piirteitä ei havaittu transkriptomissa (lisäkuva 7B), mikä viittaa transkription jälkeiseen säätelyyn.
A. Pääkomponenttianalyysin (PCA) kuvaaja, joka on väritetty sytoplasmisen ribosomaalisen geeniontologian (GO) termien mukaisesti proteomissa. Nuolet osoittavat proteiinivälitteisen variaation suunnan PCA-kuvaajassa. Viivan pituus vastaa tietyn proteiinin pääkomponenttipistemäärää. B, C. PCA-ominaisuuskuvaajat RPS13:lle ja RPL38:lle. D. Sytoplasmisen ribosomaalisten proteiinien ohjaamaton hierarkkinen klusterointianalyysi. E. 80S-ribosomin rakennemalli (PDB: 4V6X), joka korostaa ribosomaalisia proteiineja, joilla on erilaiset määrät luurankolihaskuiduissa. F. Ribosomaaliset proteiinit, joilla on erilainen stoikiometria ja jotka sijaitsevat lähellä mRNA:n poistumiskanavaa.
Ribosomien heterogeenisyyden ja erikoistumisen käsitteitä on ehdotettu aiemmin, ja niiden mukaan erillisten ribosomien alaryhmien (ribosomien heterogeenisyyden) läsnäolo voi vaikuttaa suoraan proteiinien translaatioon eri kudoksissa32 ja soluissa33 spesifisten mRNA-transkriptipoolien selektiivisen translaation kautta34 (ribosomien erikoistuminen). Tunnistaaksemme luurankolihasten säikeissä ilmentyvien ribosomien proteiinien alaryhmiä, suoritimme proteomissa olevan ribosomaalisten proteiinien valvomattoman hierarkkisen klusterointianalyysin (kuva 3D, lisätietojoukko 8). Kuten odotettua, ribosomaaliset proteiinit eivät klusteroituneet MYH:n perusteella säikeiden tyypin mukaan. Tunnistimme kuitenkin kolme erillistä ribosomaalisten proteiinien klusteria; ensimmäistä klusteria (ribosomaalinen_klusteri_1) säädellään koregulaatiolla RPL38:n kanssa, ja siksi sen ilmentyminen on lisääntynyt positiivisen PC1-profiilin omaavissa säikeissä. Toista klusteria (ribosomaalinen_klusteri_2) säädellään koregulaatiolla RPS13:n kanssa, ja sen ilmentyminen on kohonnut negatiivisen PC1-profiilin omaavissa säikeissä. Kolmas klusteri (ribosomaalinen_klusteri_3) ei osoita koordinoitua erilaista ilmentymistä luurankolihasten säikeissä, ja sitä voidaan pitää luurankolihasten "ydin"-ribosomiproteiinina. Sekä ribosomiklusterit 1 että 2 sisältävät ribosomiproteiineja, joiden on aiemmin osoitettu säätelevän vaihtoehtoista translaatiota (esim. RPL10A, RPL38, RPS19 ja RPS25) ja vaikuttavan toiminnallisesti kehitykseen (esim. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA-tulosten mukaisesti näiden ribosomiproteiinien havaittu heterogeeninen esitys säikeiden välillä osoitti myös jatkuvuutta (lisäkuva 7C).
Heterogeenisten ribosomiproteiinien sijainnin visualisoimiseksi ribosomissa käytimme ihmisen 80S-ribosomin rakennemallia (Protein Data Bank: 4V6X) (kuva 3E). Eristettyämme eri ribosomiklustereihin kuuluvat ribosomiproteiinit niiden sijainnit eivät olleet läheisesti linjassa, mikä viittaa siihen, että lähestymistapamme ei onnistunut rikastamaan tiettyjä ribosomin alueita/fraktioita. Mielenkiintoista on kuitenkin se, että suurten alayksikköproteiinien osuus klusterissa 2 oli pienempi kuin klustereissa 1 ja 3 (lisäkuva 7D). Havaitsimme, että proteiinit, joilla oli muuttunut stoikiometria luurankolihaskuiduissa, sijaitsivat pääasiassa ribosomin pinnalla (kuva 3E), mikä on yhdenmukaista niiden kyvyn kanssa olla vuorovaikutuksessa sisäisen ribosomin sisääntulokohdan (IRES) elementtien kanssa eri mRNA-populaatioissa, koordinoiden siten selektiivistä translaatiota.40, 41 Lisäksi monet proteiinit, joilla oli muuttunut stoikiometria luurankolihaskuiduissa, sijaitsivat lähellä toiminnallisia alueita, kuten mRNA:n ulostulotunnelia (kuva 3F), jotka säätelevät selektiivisesti tiettyjen peptidien translaation pidentymistä ja pysähtymistä. 42 Yhteenvetona voidaan todeta, että datamme viittaavat siihen, että luurankolihasten ribosomiproteiinien stoikiometria on heterogeeninen, mikä johtaa eroihin luurankolihasten kuitujen välillä.
Seuraavaksi pyrimme tunnistamaan nopeasti ja hitaasti keskeytettävien säikeiden tunnisteita ja tutkimaan niiden transkriptionaalisen säätelyn mekanismeja. Vertaamalla UMAP:n määrittelemiä nopeasti ja hitaasti keskeytettävien säikeiden klustereita kahdessa aineistossa (kuvat 1G–H ja 4A–B), transkriptominen ja proteominen analyysi tunnistivat 1366 ja 804 eriasteisesti esiintyvää ominaisuutta (kuvat 4A–B, lisäaineistot 9–12). Havaitsimme odotetut erot sarkomeereihin (esim. tropomyosiini ja troponiini), eksitaatio-supistuskytkentään (SERCA-isoformit) ja energiametaboliaan (esim. ALDOA ja CKB) liittyvissä tunnisteissa. Lisäksi proteiinien ubikitinaatiota sääteleviä transkripteja ja proteiineja ilmentyi eri tavoin nopeasti ja hitaasti keskeytetyissä säikeissä (esim. USP54, SH3RF2, USP28 ja USP48) (kuvat 4A–B). Lisäksi mikrobiproteiinigeeni RP11-451G4.2 (DWORF), jonka on aiemmin osoitettu ilmentyvän eri tavoin eri lampaan lihassyiden tyypeissä43 ja joka tehostaa SERCA-aktiivisuutta sydänlihaksessa44, lisääntyi merkittävästi hitaissa luustolihassyissä (kuva 4A). Vastaavasti yksittäisten syiden tasolla havaittiin merkittäviä eroja tunnetuissa signatuureissa, kuten aineenvaihduntaan liittyvissä laktaattidehydrogenaasi-isoformeissa (LDHA ja LDHB, kuva 4C ja lisäkuva 8A)45,46, sekä aiemmin tuntemattomissa säietyyppikohtaisissa signatuureissa (kuten IRX3, USP54, USP28 ja DPYSL3) (kuva 4C). Transkriptoomisten ja proteoomisten tietojoukkojen välillä oli merkittävää päällekkäisyyttä eri tavoin ilmentyneiden ominaisuuksien välillä (lisäkuva 8B), samoin kuin kerroinmuutoksen korrelaatio, joka johtui pääasiassa sarkomeeriominaisuuksien voimakkaammasta eriytyneestä ilmentymisestä (lisäkuva 8C). Merkillepantavaa on, että jotkut geenit (esim. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) osoittivat voimakasta transkription jälkeistä säätelyä vain proteomiikkatasolla ja niillä oli hitaita/nopeita nykimiskuitutyyppispesifisiä ilmentymisprofiileja (lisäkuva 8C).
A ja B tulivuoridiagrammit, joissa vertaillaan kuvioissa 1G–H esitettyjen UMAP-diagrammien (Uniform Manner Approxation and Projection) avulla tunnistettuja hitaita ja nopeita klustereita. Värilliset pisteet edustavat transkripteja tai proteiineja, jotka eroavat merkittävästi toisistaan FDR-arvolla < 0,05, ja tummemmat pisteet edustavat transkripteja tai proteiineja, jotka eroavat merkittävästi toisistaan logaritmisen muutoksen ollessa > 1. Kaksisuuntainen tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä DESeq2 Wald -testiä Benjamini–Hochberg-korjatuilla p-arvoilla (transkriptomiikka) tai Limma-lineaarista mallimenetelmää empiirisellä Bayes-analyysillä, jota seurasi Benjamini–Hochberg-korjaus monivertailuja varten (proteomiikka). C Valittujen eri tavoin ilmentyvien geenien tai proteiinien tunnusdiagrammit hitaiden ja nopeiden kuitujen välillä. D Merkitsevästi eri tavalla ilmentyneiden transkriptien ja proteiinien rikastusanalyysi. Päällekkäiset arvot rikastuvat molemmissa aineistoissa, transkriptomiarvot rikastuvat vain transkriptomissa ja proteomiarvot rikastuvat vain proteomissa. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä clusterProfiler-pakettia Benjamini–Hochberg-korjatuilla p-arvoilla. E. SCENICin tunnistamat kuitutyyppikohtaiset transkriptiotekijät, jotka perustuvat SCENICistä johdettuihin säätelijäspesifisyyspisteisiin ja kuitutyyppien väliseen erilaiseen mRNA:n ilmentymiseen. F. Hitaiden ja nopeiden kuitujen välillä eri tavalla ilmentyvien valittujen transkriptiotekijöiden profilointi.
Suoritimme sitten eri tavoin edustettujen geenien ja proteiinien ylirepresentaatioanalyysin (kuva 4D, lisätietojoukko 13). Kahden tietojoukon välillä eroavien ominaisuuksien metaboliarikastuminen paljasti odotettuja eroja, kuten rasvahappojen β-hapettumisen ja ketoniaineenvaihdunnan prosessit (hitaat kuidut), myofilamenttien/lihasten supistumisen (nopeat ja hitaat kuidut) ja hiilihydraattien kataboliset prosessit (nopeat kuidut). Myös seriini/treoniiniproteiinifosfataasiaktiivisuus oli kohonnut nopeissa kuiduissa, mikä johtui esimerkiksi säätelevistä ja katalyyttisistä fosfataasialayksiköistä (PPP3CB, PPP1R3D ja PPP1R3A), joiden tiedetään säätelevän glykogeeniaineenvaihduntaa (47) (lisäkuvat 8D–E). Muita nopeissa kuiduissa rikastuneita reittejä olivat prosessointikappaleet (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) proteomissa (lisäkuva 8F), jotka mahdollisesti osallistuvat transkription jälkeiseen säätelyyn (48), ja transkriptiotekijöiden aktiivisuus (SREBF1, RXRG, RORA) transkriptomissa (lisäkuva 8G). Hitaat kuidut rikastuivat oksidoreduktaasiaktiivisuuden (BDH1, DCXR, TXN2) (lisäkuva 8H), amidin sitoutumisen (CPTP, PFDN2, CRYAB) (lisäkuva 8I), solunulkoisen matriisin (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (lisäkuva 8J) ja reseptori-ligandiaktiivisuuden (FNDC5, SPX, NENF) (lisäkuva 8K) suhteen.
Saadaksemme lisätietoa hitaiden/nopeiden lihassyiden tyypin ominaispiirteiden taustalla olevasta transkriptionaalisesta säätelystä, suoritimme transkriptiotekijöiden rikastusanalyysin käyttämällä SCENIC49:ää (lisätietojoukko 14). Monet transkriptiotekijät rikastuivat merkittävästi nopeiden ja hitaiden lihassyiden välillä (kuva 4E). Tähän sisältyivät transkriptiotekijät, kuten MAFA, joka on aiemmin yhdistetty nopeaan lihassyiden kehitykseen,50 sekä useita transkriptiotekijöitä, joita ei ole aiemmin yhdistetty lihassyiden tyyppispesifisiin geeniohjelmiin. Näistä PITX1, EGR1 ja MYF6 olivat rikastuneimpia transkriptiotekijöitä nopeissa lihassyissä (kuva 4E). Sitä vastoin ZSCAN30 ja EPAS1 (tunnetaan myös nimellä HIF2A) olivat rikastuneimpia transkriptiotekijöitä hitaissa lihassyissä (kuva 4E). Tämän mukaisesti MAFA:a ilmentyi korkeammilla tasoilla UMAP-alueella, joka vastaa nopeita lihassyitä, kun taas EPAS1:llä oli päinvastainen ilmentymiskuvio (kuva 4F).
Tunnettujen proteiineja koodaavien geenien lisäksi on olemassa lukuisia ei-koodaavia RNA-biotyyppejä, jotka saattavat olla mukana ihmisen kehityksen ja sairauksien säätelyssä.51, 52 Transkriptomiaineistoissa useilla ei-koodaavilla RNA:illa on säietyyppispesifisyys (kuva 5A ja lisäaineisto 15), mukaan lukien LINC01405, joka on erittäin spesifinen hitaille säikeille ja jonka on raportoitu olevan vähentynyt mitokondriaalista myopatiaa sairastavien potilaiden lihaksissa.53 Sitä vastoin RP11-255P5.3, joka vastaa lnc-ERCC5-5-geeniä (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2)54, osoittaa nopealle säiketyypille spesifisyyttä. Sekä LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) että RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ovat luustolihasspesifisiä (lisäkuvat 9A–B), eikä niillä ole tunnettuja supistuvuusgeenejä 1 Mb:n genomiympäristössään, mikä viittaa siihen, että niillä on erikoistunut rooli kuitutyyppien säätelyssä viereisten supistuvuusgeenien säätelyn sijaan. LINC01405:n ja RP11-255P5.3:n hitaiden/nopeiden kuitutyyppien spesifiset ilmentymisprofiilit varmistettiin RNAscope-laitteella (kuvat 5B–C).
A. Ei-koodaavien RNA-transkriptien ilmentyminen on merkittävästi säädeltyä hitaissa ja nopeissa lihaskuiduissa. B. Edustavat RNAscope-kuvat, jotka osoittavat LINC01405:n ja RP11-255P5.3:n hitaan ja nopean lihaskuidun tyyppispesifisyyden. Skaala = 50 μm. C. Lihaskuitutyyppispesifisen ei-koodaavan RNA-ilmentymisen kvantifiointi RNAscope-määrityksen perusteella (n = 3 biopsiaa riippumattomilta henkilöiltä, verrattuna nopeita ja hitaita lihaskuituja kullakin yksilöllä). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä kaksisuuntaista Studentin t-testiä. Laatikkodiagrammit näyttävät mediaanin sekä ensimmäisen ja kolmannen kvartiilin, ja viikset osoittavat minimi- ja maksimiarvoihin. D. De novo -mikrobiproteiinin tunnistustyönkulku (luotu BioRender.comilla). E. Mikrobiproteiini LINC01405_ORF408:17441:17358 ilmentyy spesifisesti hitaissa luustolihaskuiduissa (n = 5 biopsiaa riippumattomilta osallistujilta, verrattuna nopeita ja hitaita lihaskuituja kullakin osallistujalla). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä Limmin lineaarista mallimenetelmää yhdistettynä empiiriseen Bayes-lähestymistapaan, jota seurasi Benjamini-Hochbergin menetelmä useiden vertailujen tekemiseksi p-arvokorjauksella. Laatikkodiagrammit esittävät mediaania, ensimmäistä ja kolmatta kvartiilia, ja viikset osoittavat maksimi-/minimiarvoihin.
Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että monet oletetut ei-koodaavat transkriptit koodaavat transkriptoituja mikrobiproteiineja, joista osa säätelee lihasten toimintaa.44, 55 Tunnistaaksemme mikrobiproteiineja, joilla on potentiaalista säietyyppispesifisyyttä, etsimme 1000 säikeen proteomiaineistostamme käyttämällä mukautettua FASTA-tiedostoa, joka sisälsi 1000 säikeen transkriptomiaineistosta löytyvien ei-koodaavien transkriptien sekvenssit (n = 305) (kuva 5D). Tunnistimme 197 mikrobiproteiinia 22 eri transkriptista, joista 71:n säätely oli erilaista hitaiden ja nopeiden luustolihassäikeiden välillä (lisäkuva 9C ja lisätietojoukko 16). LINC01405:lle tunnistettiin kolme mikrobiproteiinituotetta, joista yksi osoitti samanlaista hitaiden säikeiden spesifisyyttä kuin sen transkripti (kuva 5E ja lisäkuva 9D). Täten tunnistimme LINC01405:n geeniksi, joka koodaa hitaille luustolihassäikeille spesifistä mikrobiproteiinia.
Kehitimme kattavan työnkulun yksittäisten lihassyiden laajamittaiseen proteomiseen karakterisointiin ja tunnistimme kuitujen heterogeenisyyden säätelijöitä terveissä tiloissa. Käytimme tätä työnkulkua ymmärtääksemme, miten nemaliinimyopatiat vaikuttavat luustolihassyiden heterogeenisyyteen. Nemaliinimyopatiat ovat perinnöllisiä lihassairauksia, jotka aiheuttavat lihasheikkoutta ja joilla on sairastuneita lapsia, ja niihin liittyy erilaisia komplikaatioita, kuten hengitysvaikeuksia, skolioosia ja rajoittunutta raajojen liikkuvuutta. 19,20 Tyypillisesti nemaliinimyopatioissa patogeeniset variantit geeneissä, kuten aktiini alfa 1 (ACTA1), johtavat hitaasti supistuvien kuitujen lihassyiden koostumuksen hallitsevuuteen, vaikka tämä vaikutus on heterogeeninen. Yksi merkittävä poikkeus on troponiini T1 nemaliinimyopatia (TNNT1), jossa on vallitsevasti nopeita kuituja. Siten parempi ymmärtäminen nemaliinimyopatioissa havaitun luustolihassyiden säätelyhäiriön taustalla olevasta heterogeenisyydestä voi auttaa selvittämään näiden sairauksien ja lihassyiden tyypin välistä monimutkaista suhdetta.
Verrattuna terveisiin verrokkeihin (n = 3 ryhmää kohden), nemaliinimyopatiapotilaista, joilla oli mutaatioita ACTA1- ja TNNT1-geeneissä, eristetyissä lihaskuiduissa havaittiin merkittävää lihaskuituatrofiaa tai -dystrofiaa (kuva 6A, lisätaulukko 3). Tämä asetti merkittäviä teknisiä haasteita proteomiikka-analyysille saatavilla olevan materiaalin rajallisen määrän vuoksi. Tästä huolimatta pystyimme havaitsemaan 2485 proteiinia 272 luuston lihaskuidusta. Kun olimme suodattaneet vähintään 1000 kvantifioitua proteiinia kuitua kohden, 250 kuitua analysoitiin myöhemmin bioinformaattisesti. Suodattamisen jälkeen kvantifioitiin keskimäärin 1573 ± 359 proteiinia kuitua kohden (lisäkuva 10A, lisätietojoukot 17–18). Merkillepantavaa on, että huolimatta kuitukoon merkittävästä pienenemisestä, nemaliinimyopatiapotilaiden näytteiden proteomisyvyys pieneni vain hieman. Lisäksi näiden tietojen käsittely omilla FASTA-tiedostoillamme (mukaan lukien koodaamattomat transkriptit) mahdollisti viiden mikrobiproteiinin tunnistamisen nemaliinimyopatiapotilaiden luuston lihassyistä (lisätietojoukko 19). Proteomin dynaaminen alue oli merkittävästi laajempi, ja kontrolliryhmän kokonaisproteiinit korreloivat hyvin aiemman 1000-säikeisen proteomianalyysin tulosten kanssa (lisäkuva 10B–C).
A. Mikroskooppiset kuvat, jotka osoittavat kuituatrofiaa tai -dystrofiaa ja eri kuitutyyppien vallitsevuutta MYH:n perusteella ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatioissa (NM). Skaala = 100 μm. Värjäyksen toistettavuuden varmistamiseksi ACTA1- ja TNNT1-potilailla kolme potilasbiopsiaa värjättiin kaksi tai kolme kertaa (neljä leikettä tapausta kohden) ennen edustavien kuvien valintaa. B. Kuitutyyppien suhteet osallistujilla MYH:n perusteella. C. Luustolihaskuitujen pääkomponenttianalyysi (PCA) -kuvaaja nemaliinimyopatiaa sairastavilla potilailla ja verrokeilla. D. Nemaliinimyopatiaa sairastavien potilaiden ja verrokkien luustolihaskuidut projisoituna PCA-kuvaajalle, joka määritettiin kuvassa 2 analysoiduista 1000 kuidusta. Esimerkiksi tulivuorikuvaajat, joissa verrataan eroja ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatiaa sairastavien osallistujien ja verrokkien välillä sekä ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatiaa sairastavien osallistujien välillä. Värilliset ympyrät merkitsevät proteiineja, jotka erosivat merkittävästi arvolla π < 0,05, ja tummat pisteet proteiineja, jotka erosivat merkittävästi arvolla FDR < 0,05. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä Limman lineaarista mallimenetelmää ja empiirisiä Bayes-menetelmiä, minkä jälkeen suoritettiin p-arvon korjaus useiden vertailujen suorittamiseksi käyttäen Benjamini-Hochbergin menetelmää. H. Merkitsevästi eri tavalla ilmentyneiden proteiinien rikastusanalyysi koko proteomissa ja tyypin 1 ja 2A kuiduissa. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä clusterProfiler-pakettia ja Benjamini-Hochbergin korjaamia p-arvoja. I, J. Pääkomponenttianalyysin (PCA) kuvaajat, jotka on väritetty solunulkoisen matriisin ja mitokondrioiden geeniontologian (GO) termeillä.
Koska nemaliinimyopatiat voivat vaikuttaa MYH:ta ilmentävien myosäietyyppien osuuteen luustolihaksissa,19,20 tutkimme ensin MYH:ta ilmentäviä myosäietyyppejä nemaliinimyopatiaa sairastavilla potilailla ja verrokeilla. Määritimme myosäietyypin käyttämällä aiemmin 1000 myosäiemääritykselle kuvattua puolueetonta menetelmää (lisäkuvat 10D–E), emmekä jälleenkään onnistuneet tunnistamaan puhtaita 2X-myosäieitä (kuva 6B). Havaitsimme nemaliinimyopatioiden heterogeenisen vaikutuksen myosäietyyppiin, sillä kahdella ACTA1-mutaatiota sairastavalla potilaalla oli lisääntynyt tyypin 1 myosäietyyppien osuus, kun taas kahdella TNNT1-nemaliinimyopatiaa sairastavalla potilaalla oli vähentynyt tyypin 1 myosäietyyppien osuus (kuva 6B). Todellakin, MYH2:n ja nopeiden troponiini-isoformien (TNNC2, TNNI2 ja TNNT3) ilmentyminen oli vähentynyt ACTA1-nemaliinimyopatioissa, kun taas MYH7:n ilmentyminen oli vähentynyt TNNT1-nemaliinimyopatioissa (lisäkuva 11A). Tämä on yhdenmukaista aiempien raporttien kanssa, joissa on raportoitu heterogeenistä myosäikeiden tyypin vaihtamista nemaliinimyopatioissa.19,20 Vahvistimme nämä tulokset immunohistokemiallisesti ja havaitsimme, että ACTA1-nemaliinimyopatiaa sairastavilla potilailla oli vallitsevasti tyypin 1 myosäikeitä, kun taas TNNT1-nemaliinimyopatiaa sairastavilla potilailla oli päinvastainen kuvio (kuva 6A).
Yksittäisen kuidun proteomitasolla ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatiapotilaiden luurankolihaskuidut ryhmittyivät useimpien kontrollikuitujen joukkoon, ja TNNT1-nemaliinimyopatiakuidut olivat yleensä vakavimmin vaurioituneita (kuva 6C). Tämä oli erityisen ilmeistä piirrettäessä kunkin potilaan pseudo-inflatoituneiden kuitujen pääkomponenttianalyysi (PCA) -kuvaajia, jolloin TNNT1-nemaliinimyopatiapotilaat 2 ja 3 näyttivät olevan kaukaisimpia kontrollinäytteistä (lisäkuva 11B, lisätietojoukko 20). Ymmärtääksemme paremmin, miten myopatiapotilaiden kuidut vertautuvat terveisiin kuituihin, käytimme yksityiskohtaisia tietoja, jotka saatiin terveiden aikuisten osallistujien 1 000 kuidun proteomiikka-analyysistä. Projisoimme myopatiadatajoukon kuidut (ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatiapotilaat ja kontrollit) 1 000 kuidun proteomiikka-analyysistä saatuun PCA-kuvaajaan (kuva 6D). MYH-kuitutyyppien jakauma PC2:ta pitkin kontrollikuiduissa oli samanlainen kuin 1 000 kuidun proteomiikka-analyysistä saatu kuitujakauma. Nemaliinimyopatiaa sairastavilla potilailla useimmat lihassäikeet siirtyivät kuitenkin PC2:ta alaspäin, päällekkäin terveiden nopeasti supistuvien kuitujen kanssa, riippumatta niiden alkuperäisestä MYH-säiketyypistä. Näin ollen, vaikka ACTA1-nemaliinimyopatiaa sairastavilla potilailla havaittiin siirtymistä kohti tyypin 1 kuituja MYH-pohjaisilla menetelmillä kvantifioitaessa, sekä ACTA1-nemaliinimyopatia että TNNT1-nemaliinimyopatia siirsivät luustolihassäieiden proteomia kohti nopeasti supistuvia kuituja.
Sitten vertasimme suoraan kutakin potilasryhmää terveisiin verrokkeihin ja tunnistimme 256 ja 552 eri tavoin ilmentynyttä proteiinia ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatioissa (kuva 6E–G ja lisäkuva 11C, lisätietojoukko 21). Geenirikastusanalyysi paljasti mitokondrioproteiinien koordinoidun vähenemisen (kuva 6H–I, lisätietojoukko 22). Yllättäen, huolimatta säietyyppien erilaisesta vallitsevuudesta ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatioissa, tämä väheneminen oli täysin riippumaton MYH-pohjaisesta säietyypistä (kuva 6H ja lisäkuvat 11D–I, lisätietojoukko 23). Myös kolmea mikrobiproteiinia säädeltiin ACTA1- tai TNNT1-nemaliinimyopatioissa. Kaksi näistä mikroproteiineista, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (tunnetaan myös nimellä LINC00598 tai Lnc-FOXO1) ja ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), osoittivat erilaista esiintyvyyttä vain tyypin 1 lihaskuiduissa. ENSG00000215483_TR14_ORF67:n on aiemmin raportoitu olevan osallisena solusyklin säätelyssä.56 Toisaalta ENSG00000232046_TR1_ORF437:n (vastaa LINC01798:aa) määrä oli lisääntynyt sekä tyypin 1 että tyypin 2A lihaskuiduissa ACTA1-nemaliinimyopatiassa verrattuna terveisiin verrokkeihin (lisäkuva 12A, lisätietojoukko 24). Sitä vastoin nemaliinimyopatia ei vaikuttanut ribosomiproteiineihin suurelta osin, vaikka RPS17:n säätely oli alaspäin ACTA1-nemaliinimyopatiassa (kuva 6E).
Rikastusanalyysi paljasti myös immuunijärjestelmän prosessien lisääntyneen säätelyn ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatioissa, kun taas soluadheesio oli myös lisääntynyt TNNT1-nemaliinimyopatiassa (kuva 6H). Näiden solunulkoisten tekijöiden rikastuminen heijastui solunulkoisten matriisiproteiinien siirtäessä PCA:ta PC1:ssä ja PC2:ssa negatiiviseen suuntaan (eli kohti eniten vaurioituneita kuituja) (kuva 6J). Molemmissa potilasryhmissä havaittiin lisääntynyttä immuunivasteisiin ja sarkolemmassa korjautuviin mekanismeihin osallistuvien solunulkoisten proteiinien, kuten anneksiinien (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 ja niiden kanssa vuorovaikutuksessa olevan proteiinin S100A1159, ilmentymistä (lisäkuvat 12B–C). Tämän prosessin on aiemmin raportoitu tehostuvan lihasdystrofioissa60, mutta tietääksemme sitä ei ole aiemmin yhdistetty nemaliinimyopatioihin. Tämän molekyylikoneiston normaali toiminta on välttämätöntä sarkolemmassa tapahtuvalle korjaukselle vamman jälkeen ja vasta muodostuneiden lihassolujen fuusiolle lihaskuitujen kanssa58,61. Näin ollen tämän prosessin lisääntynyt aktiivisuus molemmissa potilasryhmissä viittaa korjaavaan vasteeseen lihaskuitujen epävakauden aiheuttamaan vaurioon.
Kunkin nemaliinimyopatian vaikutukset korreloivat hyvin (r = 0,736) ja osoittivat kohtuullista päällekkäisyyttä (lisäkuvat 11A–B), mikä osoittaa, että ACTA1:llä ja TNNT1:llä ei ole samanlaisia vaikutuksia proteomiin. Joitakin proteiineja säädeltiin kuitenkin vain ACTA1- tai TNNT1-nemaliinimyopatiassa (lisäkuvat 11A ja C). Profibroottinen proteiini MFAP4 oli yksi TNNT1-nemaliinimyopatian eniten säädellyistä proteiineista, mutta se pysyi muuttumattomana ACTA1-nemaliinimyopatiassa. SKIC8, PAF1C-kompleksin komponentti, joka vastaa HOX-geenin transkription säätelystä, sääteltiin alemmaksi TNNT1-nemaliinimyopatiassa, mutta ei muuttunut ACTA1-nemaliinimyopatiassa (lisäkuva 11A). ACTA1:n ja TNNT1-nemaliinimyopatian suora vertailu paljasti suuremman mitokondrioproteiinien vähenemisen ja immuunijärjestelmän proteiinien lisääntymisen TNNT1-nemaliinimyopatiassa (kuva 6G–H ja lisäkuvat 11C ja 11H–I). Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia TNNT1-nemaliinimyopatiassa havaitun suuremman atrofian/dystrofian kanssa verrattuna TNNT1-nemaliinimyopatiaan (kuva 6A), mikä viittaa siihen, että TNNT1-nemaliinimyopatia edustaa taudin vakavampaa muotoa.
Jotta voisimme arvioida, jatkuvatko nemaliinimyopatian havaitut vaikutukset koko lihastasolla, suoritimme saman TNNT1-nemaliinimyopatiapotilaiden kohortin lihasbiopsioiden massaproteomiikka-analyysin ja vertasimme niitä kontrolliryhmään (n = 3 ryhmää kohden) (lisäkuva 13A, lisätietojoukko 25). Kuten odotettua, kontrolliryhmät olivat läheisesti yhteydessä toisiinsa pääkomponenttianalyysissä, kun taas TNNT1-nemaliinimyopatiapotilailla havaittiin suurempaa näytteiden välistä vaihtelua, joka oli samanlainen kuin yksittäisten kuitujen analyysissä havaittiin (lisäkuva 13B). Massa-analyysi toisti yksittäisten kuitujen vertailun kautta korostetut eri tavoin ilmentyvät proteiinit (lisäkuva 13C, lisätietojoukko 26) ja biologiset prosessit (lisäkuva 13D, lisätietojoukko 27), mutta menetti kyvyn erottaa eri kuitutyyppejä toisistaan eikä ottanut huomioon heterogeenisiä sairausvaikutuksia kuitujen välillä.
Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että yksittäisten lihaskuitujen proteomiikka voi selvittää kliinisiä biologisia piirteitä, joita ei voida havaita kohdennetuilla menetelmillä, kuten immunoblottauksella. Lisäksi nämä tiedot korostavat aktiinisäietyypityksen (MYH) pelkän käytön rajoituksia fenotyyppisen adaptaation kuvaamisessa. Vaikka säietyypin vaihto eroaa aktiinin ja troponiinin nemaliinimyopatioiden välillä, molemmat nemaliinimyopatiat irrottavat MYH-säietyypityksen luurankolihasten kuituaineenvaihdunnasta kohti nopeampaa ja vähemmän oksidatiivista lihasproteomia.
Solujen heterogeenisuus on ratkaisevan tärkeää kudoksille, jotta ne voivat vastata monipuolisiin tarpeisiinsa. Luustolihaksissa tätä kuvataan usein kuitutyypeinä, joille on ominaista eriasteiset voimantuotto ja väsymys. On kuitenkin selvää, että tämä selittää vain pienen osan luustolihaskuitujen vaihtelusta, joka on paljon vaihtelevampaa, monimutkaisempaa ja monipuolisempaa kuin aiemmin on ajateltu. Teknologinen kehitys on nyt valaistanut luustolihaskuituja sääteleviä tekijöitä. Tietomme todellakin viittaavat siihen, että tyypin 2X kuidut eivät välttämättä ole erillinen luustolihaskuitujen alatyyppi. Lisäksi tunnistimme metaboliset proteiinit, ribosomiproteiinit ja soluihin liittyvät proteiinit luustolihaskuitujen heterogeenisyyden tärkeimmiksi määrääviksi tekijöiksi. Soveltamalla proteomiikkatyönkulkuamme sukkulamatomyopatiaa sairastaviin potilasnäytteisiin osoitimme edelleen, että MYH-pohjainen kuitutyypitys ei täysin heijasta luustolihasten heterogeenisyyttä, varsinkin kun järjestelmä on häiriintynyt. Itse asiassa, MYH-pohjaisesta kuitutyypistä riippumatta, sukkulamatomyopatia johtaa siirtymään kohti nopeampia ja vähemmän oksidatiivisia kuituja.
Luustolihassyitä on luokiteltu 1800-luvulta lähtien. Viimeaikaiset omiikka-analyysit ovat auttaneet meitä ymmärtämään eri MYH-syytytyyppien ilmentymisprofiileja ja niiden vasteita erilaisiin ärsykkeisiin. Kuten tässä kuvataan, omiikkamenetelmillä on myös etuna suurempi herkkyys säietyyppimarkkereiden kvantifioinnissa kuin perinteisillä vasta-ainepohjaisilla menetelmillä, ilman että luustolihassyiden tyypin määrittämisessä tarvitsee luottaa yhden (tai muutaman) markkerin kvantifiointiin. Käytimme toisiaan täydentäviä transkriptoomisia ja proteomiikkaprosesseja ja integroimme tulokset tutkiaksemme kuitujen heterogeenisyyden transkriptionaalista ja posttranskriptionaalista säätelyä ihmisen luustolihassyissä. Tämä työnkulku johti siihen, että puhtaita 2X-tyyppisiä kuituja ei havaittu proteiinitasolla terveiden nuorten miesten kohortin vastus lateralis -lihaksessa. Tämä on yhdenmukaista aiempien yksittäisiä kuituja koskevien tutkimusten kanssa, joissa havaittiin alle 1 % puhtaita 2X-kuituja terveissä vastus lateralis -lihaksissa, vaikka tämä tulisi vahvistaa muissakin lihaksissa tulevaisuudessa. Lähes puhtaiden 2X-kuitujen havaitsemisen välinen ero mRNA-tasolla ja vain sekoitettujen 2A/2X-kuitujen havaitsemisen välillä proteiinitasolla on hämmentävä. MYH-isoformin mRNA:n ilmentyminen ei ole vuorokausirytmiä noudattavaa,67 mikä viittaa siihen, että emme todennäköisesti ole "missanneet" MYH2:n alkamissignaalia näennäisen puhtaissa 2X-säikeissä RNA-tasolla. Yksi mahdollinen selitys, vaikkakin puhtaasti hypoteettinen, voisi olla proteiini- ja/tai mRNA-stabiilisuuden erot MYH-isoformien välillä. Itse asiassa mikään nopea säie ei ole 100 % puhdas millekään MYH-isoformille, ja on epäselvää, johtaisivatko MYH1-mRNA:n ilmentymistasot 70–90 %:n välillä yhtä suureen MYH1- ja MYH2-pitoisuuteen proteiinitasolla. Kuitenkin, kun tarkastellaan koko transkriptomia tai proteomia, klusterianalyysi voi luotettavasti tunnistaa vain kaksi erillistä klusteria, jotka edustavat hitaita ja nopeita luustolihassäikeitä, riippumatta niiden tarkasta MYH-koostumuksesta. Tämä on yhdenmukaista analyysien kanssa, joissa käytetään yksitumaisia transkriptoomisia lähestymistapoja, jotka tyypillisesti tunnistavat vain kaksi erillistä myonukleaarista klusteria.68, 69, 70 Lisäksi, vaikka aiemmat proteomiikkatutkimukset ovat tunnistaneet tyypin 2X-säikeitä, nämä kuidut eivät klusteroidu erilleen muista nopeista säikeistä ja niissä on vain pieni määrä erilaisia proteiineja verrattuna muihin MYH:hon perustuviin kuitutyyppeihin. 14 Nämä tulokset viittaavat siihen, että meidän tulisi palata 1900-luvun alun lihassyiden luokitteluun, jossa ihmisen luustolihassyitä ei jaettu kolmeen erilliseen luokkaan MYH:n perusteella, vaan kahteen ryhmään niiden metabolisten ja supistumisominaisuuksien perusteella. 63
Vielä tärkeämpää on, että lihaskuitujen heterogeenisyyttä tulisi tarkastella useilla ulottuvuuksilla. Aiemmat "omiikka"-tutkimukset ovat viitanneet tähän suuntaan ja ehdottaneet, että luurankolihaskuidut eivät muodosta erillisiä klustereita, vaan ne ovat järjestäytyneet jatkumoksi. 11, 13, 14, 64, 71 Tässä osoitamme, että luurankolihasten supistuvien ja metabolisten ominaisuuksien erojen lisäksi lihaskuidut voidaan erottaa toisistaan solujen välisiin vuorovaikutuksiin ja translaatiomekanismeihin liittyvien ominaisuuksien perusteella. Havaitsimme todellakin ribosomiheterogeenisyyttä luurankolihaskuiduissa, joka edistää heterogeenisyyttä hitaista ja nopeista kuitutyypeistä riippumatta. Tämän merkittävän lihaskuitujen heterogeenisyyden perimmäinen syy, joka on riippumaton hitaista ja nopeista kuitutyypeistä, on edelleen epäselvä, mutta se voi viitata lihaskimppujen erikoistuneeseen spatiaaliseen organisaatioon, joka reagoi optimaalisesti tiettyihin voimiin ja kuormiin,72 erikoistuneeseen solu- tai elinkohtaiseen kommunikaatioon muiden solutyyppien kanssa lihaksen mikroympäristössä73,74,75 tai ribosomiaktiivisuuksien eroihin yksittäisten lihaskuitujen sisällä. Ribosomaalisen heteroplasmian, joko RPL3:n ja RPL3L:n paralogoisen substituution kautta tai rRNA:n 2'O-metylaation tasolla, on osoitettu liittyvän luustolihasten hypertrofiaan 76,77. Multi-omiset ja spatiaaliset sovellukset yhdistettynä yksittäisten lihaskuitujen toiminnalliseen karakterisointiin edistävät entisestään ymmärrystämme lihasbiologiasta multi-omisella tasolla 78.
Analysoimalla nemaliinimyopatiapotilaiden yksittäisten lihaskuitujen proteomeja osoitimme myös yksittäisten lihaskuitujen proteomiikan hyödyllisyyden, tehokkuuden ja sovellettavuuden luustolihasten kliinisen patofysiologian selvittämisessä. Lisäksi vertaamalla työnkulkuamme globaaliin proteomiikka-analyysiin pystyimme osoittamaan, että yksittäisten lihaskuitujen proteomiikka tuottaa saman syvyyden tietoa kuin globaali kudosproteomiikka ja laajentaa tätä syvyyttä ottamalla huomioon kuitujen välisen heterogeenisyyden ja lihaskuitutyypin. ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatioissa havaittujen odotettujen (vaikkakin vaihtelevien) erojen lisäksi kuitutyyppien suhteessa terveisiin kontrolleihin verrattuna19 havaitsimme myös oksidatiivista ja solunulkoista uudelleenmuotoutumista MYH-välitteisestä kuitutyypin vaihdosta riippumatta. Fibroosia on aiemmin raportoitu TNNT1-nemaliinimyopatioissa.19 Analyysimme kuitenkin rakentaa tämän löydöksen pohjalle paljastamalla myös lisääntyneitä solunulkoisia stressiin liittyviä proteiineja, kuten anneksiinien, jotka osallistuvat sarkolemmassa korjautuviin mekanismeihin, ACTA1- ja TNNT1-nemaliinimyopatioita sairastavien potilaiden lihaskuiduissa.57,58,59 Yhteenvetona voidaan todeta, että lisääntyneet anneksiinipitoisuudet nemaliinimyopatiaa sairastavien potilaiden lihaskuiduissa voivat edustaa soluvastetta vakavasti atrofisten lihaskuitujen korjaamiseen.
Vaikka tämä tutkimus edustaa tähän mennessä suurinta yksittäisen kuidun koko lihas-omiikka-analyysiä ihmisistä, sillä on myös rajoituksia. Eristimme luurankolihassyitä suhteellisen pienestä ja homogeenisesta osallistujaotoksesta ja yhdestä lihaksesta (vastus lateralis). Siksi on mahdotonta sulkea pois tiettyjen kuitupopulaatioiden olemassaoloa eri lihastyypeissä ja lihasfysiologian äärivaiheissa. Emme esimerkiksi voi sulkea pois mahdollisuutta, että osa ultranopeista kuiduista (esim. puhtaat 2X-kuidut) esiintyisi erittäin harjoitelleilla pikajuoksijoilla ja/tai voimaurheilijoilla79 tai lihasten passiivisuuden aikana66,80. Lisäksi osallistujien rajallinen otoskoko esti meitä tutkimasta sukupuolten välisiä eroja kuitujen heterogeenisyydessä, koska kuitutyyppien suhteiden tiedetään vaihtelevan miesten ja naisten välillä. Emme myöskään pystyneet suorittamaan transkriptoomisia ja proteomiikka-analyysejä samoille lihaskuiduille tai samojen osallistujien näytteille. Kun me ja muut jatkamme yksisoluisten ja yksittäisten lihaskuitujen analyysien optimointia omiikka-analyysin avulla erittäin pienen näytemäärän saavuttamiseksi (kuten tässä on osoitettu mitokondriaalista myopatiaa sairastavien potilaiden kuitujen analyysissä), mahdollisuus yhdistää moni-omiikka- (ja toiminnalliset) lähestymistavat yksittäisten lihaskuitujen sisällä tulee ilmeiseksi.
Kaiken kaikkiaan datamme tunnistaa ja selittää luustolihasten heterogeenisyyden transkriptionaalisia ja posttranskriptionaalisia ajureita. Tarkemmin sanottuna esittelemme dataa, joka kyseenalaistaa luustolihasten fysiologiassa pitkään vallinneen dogman, joka liittyy klassiseen MYH-pohjaiseen kuitutyyppien määritelmään. Toivomme voivamme uudistaa keskustelua ja lopulta miettiä uudelleen ymmärrystämme luustolihasten kuitujen luokittelusta ja heterogeenisyydestä.
Neljätoista valkoihoista osallistujaa (12 miestä ja 2 naista) suostui vapaaehtoisesti osallistumaan tähän tutkimukseen. Tutkimuksen hyväksyi Gentin yliopistollisen sairaalan eettinen toimikunta (BC-10237), se noudatti vuoden 2013 Helsingin julistusta ja rekisteröitiin ClinicalTrials.gov-sivustolle (NCT05131555). Osallistujien yleiset ominaisuudet on esitetty lisätaulukossa 1. Suullisen ja kirjallisen tietoisen suostumuksen saamisen jälkeen osallistujille tehtiin lääkärintarkastus ennen lopullista tutkimukseen sisällyttämistä. Osallistujat olivat nuoria (22–42-vuotiaita), terveitä (ei sairauksia, ei tupakointihistoriaa) ja kohtalaisen fyysisesti aktiivisia. Maksimaalinen hapenottokyky määritettiin askelergometrillä fyysisen kunnon arvioimiseksi aiemmin kuvatulla tavalla.81
Lihasbiopsianäytteet kerättiin levossa ja paastotilassa kolme kertaa 14 päivän välein. Koska nämä näytteet kerättiin osana laajempaa tutkimusta, osallistujat nauttivat lumelääkettä (laktoosia), H1-reseptorin antagonistia (540 mg feksofenadiinia) tai H2-reseptorin antagonistia (40 mg famotidiinia) 40 minuuttia ennen biopsiaa. Olemme aiemmin osoittaneet, että nämä histamiinireseptorin antagonistit eivät vaikuta lepotilassa olevien luustolihasten kuntoon81, eikä laatukontrollikuvioissamme havaittu tilaan liittyvää kasautumista (lisäkuvat 3 ja 6). Standardoitua ruokavaliota (41,4 kcal/kg ruumiinpainoa, 5,1 g/kg hiilihydraatteja, 1,4 g/kg ruumiinpainoa proteiinia ja 1,6 g/kg rasvaa) noudatettiin 48 tuntia ennen jokaista koepäivää, ja standardoitu aamiainen (1,5 g/kg ruumiinpainoa hiilihydraatteja) nautittiin koepäivän aamuna. Paikallispuudutuksessa (0,5 ml 1 % lidokaiinia ilman adrenaliinia) otettiin lihasbiopsiat reversiaalilihaksesta perkutaanisella Bergströmin aspiraatiolla.82 Lihasnäytteet upotettiin välittömästi RNAlateriin ja säilytettiin 4 °C:ssa manuaaliseen kuitudisektioon asti (enintään 3 päivää).
Tuoreet eristetyt lihaskuitukimput siirrettiin tuoreeseen RNAlater-kasvatusalustaan. Yksittäiset lihaskuidut dissektoitiin sitten manuaalisesti stereomikroskoopilla ja hienoilla pinseteillä. Jokaisesta biopsiasta dissektoitiin 25 kuitua kiinnittäen erityistä huomiota kuitujen valitsemiseen biopsian eri alueilta. Dissektion jälkeen jokainen kuitu upotettiin varovasti 3 μl:aan lysispuskuria (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad), joka sisälsi proteinaasi K- ja DNase-entsyymejä ei-toivottujen proteiinien ja DNA:n poistamiseksi. Solujen lyysi ja proteiinin/DNA:n poisto käynnistettiin sitten lyhyellä vorteksoinnilla, nesteen pyörityksellä mikrosentrifugissa ja inkuboinnilla huoneenlämmössä (10 min). Lysaattia inkuboitiin sitten lämpösyklerissä (T100, Bio-Rad) 37 °C:ssa 5 minuuttia, 75 °C:ssa 5 minuuttia ja säilytettiin sitten välittömästi -80 °C:ssa jatkokäsittelyyn asti.
Illumina-yhteensopivat polyadenyloidut RNA-kirjastot valmistettiin 2 µl:sta myofibrillyysiä käyttäen QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit -pakkausta (Lexogen). Yksityiskohtaiset menetelmät löytyvät valmistajan käyttöoppaasta. Prosessi alkaa ensimmäisen juosteen cDNA-synteesillä käänteiskopioinnilla, jonka aikana lisätään yksilölliset molekyylitunnisteet (UMI) ja näytekohtaiset i1-viivakoodit näytteiden yhdistämisen varmistamiseksi ja teknisen vaihtelun vähentämiseksi jatkokäsittelyn aikana. 96 myofibrillin cDNA yhdistetään ja puhdistetaan sitten magneettihelmillä, minkä jälkeen RNA poistetaan ja toisen juosteen synteesi suoritetaan käyttämällä satunnaisia alukkeita. Kirjasto puhdistetaan magneettihelmillä, poolikohtaiset i5/i7-tunnisteet lisätään ja PCR-monistetaan. Viimeinen puhdistusvaihe tuottaa Illumina-yhteensopivia kirjastoja. Kunkin kirjastopoolin laatu arvioitiin käyttämällä High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit -pakkausta (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Qubit-kvantifioinnin perusteella poolit yhdistettiin edelleen ekvimolaarisilla pitoisuuksilla (2 nM). Tuloksena oleva pooli sekvensoitiin sitten NovaSeq 6000 -laitteella standarditilassa käyttäen NovaSeq S2 -reagenssipakkausta (1 × 100 nukleotidia) ja 2 nM:n latausta (4 % PhiX).
Prosessiprosessimme perustuu Lexogenin QuantSeq Pool -data-analyysiprosessiin (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Data demultipleksoitiin ensin bcl2fastq2:lla (v2.20.0) i7/i5-indeksin perusteella. Lukema 2 demultipleksoitiin sitten idemuxilla (v0.1.6) i1-näytteen viivakoodin perusteella ja UMI-sekvenssit erotettiin umi_tools-ohjelmalla (v1.0.1). Lukemia karsittiin sitten cutadapt-ohjelmalla (v3.4) useissa kierroksissa lyhyiden lukemien (<20 merkkiä pitkät) tai pelkästään adapterisekvensseistä koostuvien lukemien poistamiseksi. Lukemat kohdistettiin sitten ihmisen genomiin käyttämällä STAR-ohjelmaa (v2.6.0c) ja BAM-tiedostot indeksoitiin SAMtools-ohjelmalla (v1.11). Kaksoiskappaleet poistettiin umi_tools-ohjelmalla (v1.0.1). Lopuksi kohdistuslaskenta suoritettiin käyttämällä featureCounts-ohjelmaa Subread-ohjelmassa (v2.0.3). Laadunvalvonta suoritettiin FastQC:llä (v0.11.9) useissa prosessin välivaiheissa.
Kaikki jatkossa tehtävä bioinformatiikan käsittely ja visualisointi tehtiin R:ssä (v4.2.3), pääasiassa käyttäen Seurat (v4.4.0) -työnkulkua.83 Siksi yksittäiset UMI-arvot ja metatietomatriisit muunnettiin Seurat-objekteiksi. Alle 30 %:ssa kaikista kuiduista ilmentyneet geenit poistettiin. Heikkolaatuiset näytteet poistettiin 1000 UMI-arvon ja 1000 havaitun geenin vähimmäiskynnyksen perusteella. Lopulta 925 kuitua läpäisi kaikki laadunvalvonnan suodatusvaiheet. UMI-arvot normalisoitiin Seurat SCTransform v2 -menetelmällä,84 mukaan lukien kaikki 7418 havaittua ominaisuutta, ja osallistujien väliset erot regressioitiin pois. Kaikki asiaankuuluvat metatiedot löytyvät lisäaineistosta 28.
Julkaisun aika: 10. syyskuuta 2025